制备用于测序的核酸的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了制备用于测序的核酸的方法及其应用，其中，制备用于测序的核酸的方法包括：提供第一序列，所述第一序列包含靶序列和第一重组酶识别序列；提供第二序列，所述第二序列包括：中间段：所述中间段形成至少一个双链体区域，且含有第二重酶识别序列，且所述第一重组酶识别序列与所述第二重酶识别序列具有至少一个相同的酶切序列；两个接头段：所述两个接头段分别位于所述中间段的端部，且每个所述接头段含有至少一个单链体区域，且其中一个接头段含有至少一个引物结合位点；以及将所述第一序列和所述第二序列接触，进行重组反应，以便获得所述用于测序的核酸，所述用于测序的核酸含有所述靶序列。

Preparation and application of nucleic acid for sequencing

【技术实现步骤摘要】
制备用于测序的核酸的方法及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及基因检测领域。
技术介绍
Pacbio(PB)测序使用phi29进行基础改造，使测序酶的行进速度减慢，从而能从连续录像中得到更精确的碱基区分度，但这种改造也引入了更高的嘌呤-嘧啶的行进速度差异。聚合酶对嘌呤的偏好性是一个受到广泛报道的现象，而DNA双链的嘌呤-嘧啶的互补特性，引起了DNA双链上的嘌呤-嘧啶不平衡的特性。对于PB平台使用聚合酶实时连续合成的特性，必然会导致嘌呤-嘧啶不平衡的互补双链上聚合酶在一条链上运行较快，一条运行较慢，其差异取决于嘌呤-嘧啶的比例差异。PB使用的文库结构是SMRTbell结构，测序引物(聚合酶起始)区域位于接头单链环区。PB的操作规范，是用测序引物和SMRTbell环进行退火，再使聚合酶结合到测序引物结合区，这样基于SMRTbell的接头会结合在DNA双链分子的两端，从而避免不了有两个测序聚合酶落在一个测序分子上。基于聚合酶对嘌呤的偏好性，必然会导致在测序分子上的两个酶互相追赶，因为其中一个酶会固定在ZMW的底部，当两个酶接近的时候，会产生的结果有2种：1)同时产生两个荧光信号，这两种信号互相重叠干扰，影响有效信号的产出比例；2)置后酶分子顶开了前方的固定在ZMW上的酶分子，或前置分子限制了固定在ZMW上酶分子的速度，使运行速度变慢，增加DNA链脱落的概率，测序信号从而中止，影响了测序文库的结构。由此，用于PB平台的测序文库的构建方法有待优化。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种制备用于测序的核酸的方法，在一端的接头上具有引物结合位点，使聚合酶只能结合到一端的接头上进行测序，文库结构好，测序数据产出量大。因而，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种制备用于测序的核酸的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：提供第一序列，所述第一序列包含靶序列和第一重组酶识别序列；提供第二序列，所述第二序列包括：中间段：所述中间段形成至少一个双链体区域，且含有第二重酶识别序列，且所述第一重组酶识别序列与所述第二重酶识别序列具有至少一个相同的酶切序列；两个接头段：所述两个接头段分别位于所述中间段的端部，且每个所述接头段含有至少一个单链体区域，且其中一个接头段含有至少一个引物结合位点；以及将所述第一序列和所述第二序列接触，进行重组反应，以便获得所述用于测序的核酸，所述用于测序的核酸含有所述靶序列。根据本专利技术实施例的制备用于测序的核酸的方法，在一端的接头上具有引物结合位点，使聚合酶只能结合到一端的接头上进行测序，文库结构好，测序数据产出量大。另外，根据本专利技术上述实施例的制备用于测序的核酸的方法，还可以具有如下附加的技术特征：根据本专利技术的实施例，所述接头段呈发夹型结构。根据本专利技术的实施例，所述第一重组酶识别序列和所述第二重酶识别序列均选自下列序列的至少一种：LoxP位点序列、Lox66位点序列、Lox511位点序列、Lox2272位点序列、Lox2372位点序列、Lox5171位点序列、Loxm2位点序列、LoxFas位点和frt位点。根据本专利技术的实施例，所述第一序列为环状序列。根据本专利技术的实施例，所述第一序列含有单向第一重组酶识别序列。根据本专利技术的实施例，所述第一序列含有双向第一重组酶识别序列。根据本专利技术的实施例，该方法进一步包括：预处理，所述预处理包括：在所述靶序列进行末端修复和加碱基A处理；将处理后的序列与所述第一重组酶识别序列连接；将连接后的序列进行环化处理，以便得到所述第一序列。根据本专利技术的实施例，所述处理后的序列的一端或两端与所述第一重组酶识别序列相连。根据本专利技术的实施例，所述引物结合位点为通用引物结合位点。根据本专利技术的另一方面，本专利技术提供了一种用于测序的核酸组合物。根据本专利技术的实施例，该组合物包括前述的用于测序的核酸。根据本专利技术实施例的用于测序的核酸组合物，其中核酸在一端的接头上具有引物结合位点，使聚合酶只能结合到一端的接头上进行测序，文库结构好，测序数据产出量大。其中，需要说明的是，该组合物中用于测序的核酸具有前述用于测序的核酸的全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。根据本专利技术的实施例，该组合物进一步包括：具有链置换活性的核酸聚合酶。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了现有的SMRTbell文库的结构示意图；图2显示了根据本专利技术一个实施例的SMRTbell文库的结构示意图；图3显示了根据本专利技术一个实施例的测序数据产量示意图，其中，A为SMRTbell的两端接头均添加聚合酶的测序数据产量，B为SMRTbell的一端接头均添加聚合酶的测序数据产量；图4显示了根据本专利技术一个实施例的文库结构示意图；图5显示了根据本专利技术一个实施例的构建文库的流程示意图；图6显示了根据本专利技术一个实施例的重组反应的流程示意图；图7显示了根据本专利技术一个实施例的接头结构示意图，其中，A为PB公司官方的接头，B为专利技术人自行设计的接头；图8显示了根据本专利技术一个实施例的聚合酶读长结果示意图，其中，A为样品1的结果，B为样品2的结果；图9显示了根据本专利技术一个实施例的下机数据结果示意图，其中，A为样品1的结果，B为样品2的结果；图10显示了根据本专利技术一个实施例的聚合酶读长结果示意图，其中，A为样品1的结果，B为样品2的结果；图11显示了根据本专利技术一个实施例的下机数据结果示意图，其中，A为样品1的结果，B为样品2的结果；图12显示了根据本专利技术一个实施例的HQ区域起始位点分布结果示意图，其中，A为样品1的结果，B为样品2的结果；图13显示了根据本专利技术一个实施例的制备用于测序的核酸的方法的流程示意图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本专利技术的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的：目前PB官方构建的两端加有相同接头序列的SMRTbell文库，如图1所示，会出现两端都结合上测序酶情况，由于两个测序酶的行进速度不同，导致两个酶在一定时间内追赶上，进而导致测序酶读长低。专利技术人发现，通过改造本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备用于测序的核酸的方法，其特征在于，包括：/n提供第一序列，所述第一序列包含靶序列和第一重组酶识别序列；/n提供第二序列，所述第二序列包括：/n中间段：所述中间段形成至少一个双链体区域，且含有第二重酶识别序列，且所述第一重组酶识别序列与所述第二重酶识别序列具有至少一个相同的酶切序列；/n两个接头段：所述两个接头段分别位于所述中间段的端部，且每个所述接头段含有至少一个单链体区域，且其中一个接头段含有至少一个引物结合位点；以及/n将所述第一序列和所述第二序列接触，进行重组反应，以便获得所述用于测序的核酸，所述用于测序的核酸含有所述靶序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种制备用于测序的核酸的方法，其特征在于，包括：
提供第一序列，所述第一序列包含靶序列和第一重组酶识别序列；
提供第二序列，所述第二序列包括：
中间段：所述中间段形成至少一个双链体区域，且含有第二重酶识别序列，且所述第一重组酶识别序列与所述第二重酶识别序列具有至少一个相同的酶切序列；
两个接头段：所述两个接头段分别位于所述中间段的端部，且每个所述接头段含有至少一个单链体区域，且其中一个接头段含有至少一个引物结合位点；以及
将所述第一序列和所述第二序列接触，进行重组反应，以便获得所述用于测序的核酸，所述用于测序的核酸含有所述靶序列。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接头段呈发夹型结构。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一重组酶识别序列和所述第二重酶识别序列均选自下列序列的至少一种：LoxP位点序列、Lox66位点序列、Lox511位点序列、Lox2272位点序列、Lox2372位点序列、Lox5171位点序列、Loxm2位点序列、LoxFas位点和frt位点。


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【专利技术属性】
技术研发人员：潘伟业，王亚蕾，杨新芳，李艳秋，张介中，李志民，李大为，玄兆伶，王海良，王娟，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11