本发明专利技术公开了lncRNA H19的靶蛋白FUS在制备和/或筛选治疗肿瘤的药物中的应用；还公开了lncRNA H19和FUS的联合使用在制备和/或筛选治疗肿瘤的药物中的应用。本发明专利技术中采用FUS的靶向抑制剂后，减弱了K562细胞的colony(集落)形成能力，表明通过靶向抑制FUS的表达水平能有效抑制肿瘤的增殖；同时，本发明专利技术中通过提升lncRNA H19表达水平后，能抑制肿瘤的生长，延长患有肿瘤的小鼠的存活时间，说明能促进lncRNA H19表达水平的试剂具有抑制肿瘤的效果。
Target protein FUS of lncRNA H19 and its application
The invention discloses the application of target protein FUS of lncRNA H19 in the preparation and/or screening of drugs for cancer treatment, and also discloses the application of combined use of lncRNA H19 and FUS in the preparation and/or screening of drugs for cancer treatment. The targeting inhibitor of FUS in the present invention weakens the colony forming ability of K562 cells, which indicates that the targeting inhibition of the expression level of FUS can effectively inhibit the proliferation of tumors. At the same time, the present invention can inhibit the growth of tumors and prolong the survival time of mice with tumors by increasing the expression level of lncRNA H19, which indicates that it can promote the test of the expression level of lncRNA H19. The agent has the effect of inhibiting tumors.
【技术实现步骤摘要】
lncRNAH19的靶蛋白FUS及其应用
本专利技术涉及恶性肿瘤的治疗方法，尤其是lncRNAH19的靶蛋白FUS及其应用。
技术介绍
慢性粒细胞白血病(chronicmyelocyticleukemia,CML)是一种发生在多能造血干细胞上的恶性骨髓增殖性肿瘤。CML患者往往会出现特征性的染色体异位t(9:22)(q34:q11)(即Ph染色体)，其9号染色体2上C-ABL原癌基因易位至22号染色体长臂的断裂点簇集区(BCR)，形成BCR-ABL融合基因，异常表达BCR-ABL蛋白，导致络氨酸激酶的持续激活，并且导致下游的信号转导通路被活化，从而调节细胞因子的表达，最终导致骨髓干祖细胞大量增生、凋亡减少和骨髓基质细胞的粘附性下降，致使大量尚未成熟的髓细胞释放到外周血，导致CML发生。依据疾病的整体发展过程，在临床上其发展进程被分为三个时期，分别为慢性期(Chronicphase，CP)、加速期(Acceleratedphase,AP)和急变期(Blasticphase,BP)。慢性期疾病症状轻微无特异性，主要表现为腹胀、腹部肿块、乏力、低热、脾大，见于90％患者，病症程度不一。随着基因组测序技术的迅速发展，人们发现RNA可以由60％～70％的基因组序列转录而成，但是其中只有不到2％的编码蛋白质的序列，其余被称为非编码RNA。事实上，很多年前，许多非编码RNA就被发现对生命活动有重要影响，例如涉及蛋白质合成的核糖体RNA(rRNAs)、转运RNA(tRNA)和小核RNA(snRNA)，并且这些非编码RNA通常被称为持家非编码RNA。近年来非编码RNA引起广泛关注，这些RNA主要是指具有生命调节作用的非编码RNA，包括microRNA和本文研究的RNA(LncRNA)。研究已经发现LncRNA是指长度大于200个核苷酸并且由RNA聚合酶Ⅱ转录且缺少或无开放阅读框架的RNA，它可来源于基因间、增强子原件、基因的反义链、内含子区基因组的其他位置。随着对长链非编码RNA研究的不断深入，发现LncRNA具有很多重要的功能，参与了机体重要的生物学过程，包括细胞分化、衰老、增值、凋亡和肿瘤的发生发展等。多种LncRNA如H19、X染色体特异性性失活转录物(Xist)等参与基因印记。Pachnis等在1984年发现H19基因尽管可被RNA聚合酶Ⅱ转录，可以被剪切并加尾，但其转录出来的产物却无法翻译成有生物学功能的蛋白质，而是以非编码RNA的形式来发挥作用。由于H19产物长度超过了200nt，故将其定义为LncRNA。在小鼠体内H19与IGF2存在于第七号染色体，在人体则位于11p15.5，两者相距90kb，这属于第一对被证实为具有印记特性的基因。H19体现为父系印记和母系表达，而IGF2则体现为父系表达和母系印记。二者的印记特性都受到H19启动子上游4kb的甲基化差异修饰区(DMR)或印记调控区域(ICR)的调控。在物种进化上，H19具有高度保守的特征，在三个时期内高表达，分别是胚胎发育时的内胚层、中胚层及其分化而来的组织内，但是出生后，除了心脏和骨骼肌外，其他组织内几乎不表达，除非在三种情况下会重新激活表达：组织损伤修复和应激状态以及肿瘤发生时。H19全长2.3kb，由35个小的开放阅读框，且具有类似mRNA的5′端帽子结构和3′端多聚腺苷酸尾巴结构，理论上可编码一种包含256个氨基酸分子的蛋白质，但是LncRNA仅仅在mRNA水平发挥作用，并无法编码任何蛋白质分子。H19第一个启动子中的高度保守区域编码的miRNA-675分子，可在妊娠后期通过调节IGFLR基因的表达控制胎盘的生长。研究发现，H19在人体胎盘素和一些胚胎组织中大量聚集，表示H19可能在胚胎形成和生长发育期起很重要的作用。胎儿出生后，H19表达下调，但在乳腺、肾上腺和子宫组织中扔维持基础表达量。目前有报道表明，在肾母细胞瘤、胚胎横纹肌肉瘤中，H19起抑癌基因的作用，然而许多实体瘤(包括乳腺癌、肝癌、膀胱癌等)中，H19是一个致癌基因。这表明，人体内H19通过不同的机制参与机体肿瘤的形成和进展。这些不同的机制中还有许多未知环节有待进一步的研究发现。
技术实现思路
基于上述问题，本申请的专利技术人在研究H19参与机体肿瘤的形成和进展的具体机制的过程中，意外地发现通过提升lncRNAH19的表达水平或抑制lncRNAH19的靶蛋白FUS，能有效地抑制肿瘤细胞的增殖。具体地，本专利技术的技术方案包括以下几个方面：在第一个方面，本专利技术提供了lncRNAH19的靶蛋白FUS在制备和/或筛选治疗肿瘤的药物中的应用。优选地，所述肿瘤为白血病。在第二个方面，本专利技术提供了lncRNAH19和FUS的联合使用在制备和/或筛选治疗肿瘤的药物中的应用。其中，lncRNAH19的过表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，FUS的低表达可以抑制肿瘤细胞的集落形成能力(colony)。优选地，所述肿瘤为恶性肿瘤。在第三个方面，本专利技术提供了一种治疗肿瘤的药物，所述药物中含有FUS的抑制剂。优选地，所述抑制剂为PCBP1的靶向SiRNA。优选地，所述药物中还含有能促进lncRNAH19表达水平的试剂或载体。优选地，所述抑制剂的碱基序列如PCBP1-SiRNA-03(即SEQIDNO.8)所示。更优选地，所述肿瘤为血癌。综上所述，本专利技术的有益效果为：本专利技术中采用FUS的靶向抑制剂后，减弱了K562细胞的colony形成能力，表明通过靶向抑制FUS的表达水平能有效抑制肿瘤的增殖；同时，本专利技术中通过提升lncRNAH19表达水平后，能抑制肿瘤的生长，延长患有肿瘤的小鼠的存活时间，说明能促进lncRNAH19表达水平的试剂具有抑制肿瘤的效果。附图说明图1为慢病毒载体结构图；图2为正常对照组与K562和KCL-22细胞H19的表达水平的检测结果图；图3为Real-timePCR对H19-SiRNA有效序列的筛选结果图；图4为K562-H19LentiV和K562emptyLentiV中的H19的表达水平的检测结果图；图5为K562-H19Lenti和K562-emptyLentiV组的colony数目检测结果图，其中A为集落图(40×)；B为相对集落数；图6为H19过表达对BALB/cnude小鼠的影响结果图；其中，A显示了注射过表达H19的P210细胞后，小鼠肿瘤的大小；B显示了注射过表达H19的P210细胞后对小鼠存活的影响；C显示了注射过表达H19的P210细胞后，小鼠肿瘤体积的统计结果；图7为NOD/SCID小鼠尾静脉移植K562-NEG-LentiV和K562-H19LentiV，活体成像观察小鼠发病率，记录小鼠存活率的结果图。图8为PCR产物的鉴定结果；其中A为PCR产物后的琼脂糖凝胶电泳图。B为PCR产物测序(序列已经带上T7启动子)结果；图9为体外转录后的lncRNAH19琼脂糖凝胶电泳图；图10为K562细胞裂解液与RNA孵育进行RNApull-down的结果图，其中用10％SDS-PAGE分离复合物中的蛋白，考马斯亮蓝染色；图11为catRAPID软件和starBasev2.0软件预测的结果图；其中显示在长链非编码RNAH19pull-down产物中，存在PCBP1和FUS蛋白，catR本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.lncRNA H19的靶蛋白FUS在制备和/或筛选治疗肿瘤的药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.lncRNAH19的靶蛋白FUS在制备和/或筛选治疗肿瘤的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为白血病。3.lncRNAH19和FUS的联合使用在制备和/或筛选治疗肿瘤的药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为恶性肿瘤。5.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，所述药物中含有FUS...
【专利技术属性】
技术研发人员：费嘉，杨菊华，
申请(专利权)人：广州安镝声生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44
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