稻曲病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于稻曲病菌孢子的q‑LAMP快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，该LAMP特异性引物组合物由上下游外引物、上下游内引物这四条引物组成。本发明专利技术还同时公开了一种用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增试剂盒，其包含上述LAMP特异性引物组合物，还包含甜菜碱、10×SYBR Green I、8U/μL Bst DNA聚合酶等。本发明专利技术还相应公开了一种用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增方法。

Real-time quantitative loop mediated isothermal amplification detection method and kit for the spores of Oryza Oryza

The invention discloses a LAMP specific primer composition for Q LAMP method for rapid detection of u.virens conidia, the LAMP specific primer composition by downstream outer primers, downstream primers in the four primers. The invention also discloses a guide loop mediated isothermal amplification kit for quantitative detection of u.virens conidia, which contains the LAMP specific primer composition also contains betaine, 10 x SYBR Green I, 8U/ L Bst DNA polymerase. The invention also discloses a ring mediated isothermal amplification method for quantitative detection of spores of Oryza Oryza.

【技术实现步骤摘要】
稻曲病菌孢子实时定量环介导等温扩增检测法及试剂盒
本专利技术涉及一种稻曲病的实时定量环介导等温扩增(q-LAMP)检测方法及试剂盒，属于植物病害检测、鉴定及防治的早期预警

技术介绍
水稻稻曲病是由稻曲病菌(Ustilaginoideavirens(Cooke)Tak.)引起的一种世界性水稻病害，在中国、日本和印度等国家危害较重。该病害为穗部病害，刚开始在穗部形成白色的稻曲球，然后很快转变成黄色或是墨绿色的稻曲球。该病显著地影响水稻产量和稻米品质，发病严重的年份产量损失率为30-50％，并且加工后的稻米混有大量厚垣孢子。稻曲病菌厚垣孢子含有真菌毒素Ustilaxin。日本研究者的动物毒性实验结果表明，厚垣孢子水浸出液和微量UstilaxinA能引起动物器官病变和植物生长异常。我国研究者的试验也表明用混有稻曲病粒的谷糠饲养家畜、家禽能引起慢性中毒，使其内脏发生病变。稻曲病的发生不但对水稻的产量造成很大影响，而且稻曲病菌能够产生大量毒素不仅对畜禽业生产带来威胁，还会对人的健康构成危害，稻曲病已成为稻米安全的重要问题之一。当前，我国人民对农产品的需求已经逐渐从数量型消费向质量型消费转变，随着人们对绿色食品的日益重视，稻曲病对我国稻米无公害生产的影响将日益突出。稻曲病是目前最难防控的水稻主要有害生物之一，主要原因是现有技术难以及时快捷地掌握其侵染动态。这导致很多药剂对稻曲病菌有很高的抑制活性，但实际应用时效果不佳。主要原因是由于缺乏灵敏、快捷的病菌监测技术，无法做到科学用药、科学防治。目前虽然采用人工分离培养和常规的显微镜观察可以检查土壤中越冬厚垣孢子的数量；但是稻田中微生物种类繁多，稻曲病菌生长速度缓慢，并且厚垣孢子萌发产生的菌丝和分生饱子没有特异的形态特征，采用显微镜观察和分离培养等病理学手段都难以鉴定，无法了解水稻生长季节田间稻曲病菌的数量变化和对植株的侵染及其在植株中的增殖状况，这些监测技术耗时都在一周以上。随着核酸相关的鉴定方法不断发展，基于普通PCR的方法已经成功用于病原菌的检测，但PCR法特异性等检测耗时偏长，需要6～8h，且反应容易受PCR抑制剂的影响，前处理过程复杂。同时PCR方法需要昂贵仪器PCR仪，且检测灵敏度偏低，检测过程较繁杂。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本荣研株式会社专利技术的一种新的核酸扩增技术，因为其扩操作简便、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4对特异性引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60-65℃范围60min内，能大量合成目标DNA。扩增产物的检测一般采用荧光染料目测观察、琼脂糖凝胶电泳和浊度观察等方法。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者等温保温瓶就能满足反应要求，检测成本降低，所需时间短。由于反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一套用于实时定量检测稻曲病菌的环介导等温扩增引物组合物、含有该引物的试剂盒以及相应的用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种检测稻曲病菌孢子的q-LAMP引物组合物(LAMP特异性引物组合物)，由上下游外引物，上下游内引物四条引物组成，引物序列如下：上游外引物(F3)：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；下游外引物(B3)：5’—GAGGATCTTCAAGCACCTTGG—3’；上游内引物(FIP)：5’—TCTACCCCGCAACTCAGCCCGCGGTTCGTCCGTTTTCG—3’；下游内引物(BIP)：5’—AGGAGGGGAACTGACACAGGGATTGGCCATGCGTCCATC—3’。本专利技术还同时提供了用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增试剂盒(q-LAMP试剂盒)：包含上述LAMP特异性引物组合物。具体为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3。本专利技术所述的q-LAMP试剂盒，包含环介导等温扩增引物混合液和环介导等温扩增反应预混液构成的检测溶液，引物组合混合液浓度为：1.6μM的正内向引物FIP，1.6μM的反向内引物BIP、0.2μM正向外引物F3、0.2μM反向外引物B3；环介导等温扩增反应预混液：10×ThermoPolBuffer、1mMdNTPs、4mMMgCl2、0.6M甜菜碱、10×SYBRGreenI、8U/μLBstDNA聚合酶、ddH2O。检测溶液共19μL，加入待测DNA模板1μL，构成20μL检测反应体系。所述20μL反应体系中含有8U/μL的BstDNA聚合酶0.5μL(4U)、10×ThermoPolBuffer2.5μL、20μM的FIP引物2.0μL、20μM的BIP引物2.0μL、10μM的F3引物0.5μL、10μM的B3引物0.5μL、25mM的MgCl24.0μL、10mM的dNTPs2.5μL、5M的甜菜碱3.0μL、10×SYBRGreenI1μL、DNA模板1μL，双蒸水补足至20μL。本专利技术还提供所述引物组合或所述试剂盒在定量检测稻曲病菌的应用。本专利技术还提供了一种用于定量检测的稻曲病菌的环介导等温扩增方法，利用上述20μL检测反应体系进行q-LAMP扩增反应。q-LAMP扩增反应程序为：64℃，1min，60个循环；80℃，10min，终止反应。扩增结果的分析和判定方法包括：在扩增前加入SYBRGreenI作为反应指示剂，以荧光信号做为结果判定依据，反应结束后仪器自动根据标准曲线显示定量结果。根据CT值与梯度稀释稻曲病菌孢子溶液的基因组制成标准曲线，再根据待测样品的CT值，可准确算出该样品的孢子起始浓度。定量线性回归方程为y＝-0.2866x+13.829，其中为y为稻曲病菌孢子数对数值，x为CT值。基于已定量的标准样品做出的标准曲线方程，标准品浓度的对数值与Ct值之间的相关系数R2>0.99，为定量未知样品的DNA提供了理论依据。本专利技术的方法能定量检测稻曲病菌，克服以往实时荧光定量PCR检测方法的不足，具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点，采用不开盖就能灵敏地检测反应产物的策略，该方法不易受污染物的影响且能现场检测环境中的样品，分析判断反应产物的方法极为简单，适宜于广泛地推广应用。本专利技术的方案包括：(1)根据稻曲病菌毒素合成相关的核糖体肽合成酶基因序列(NCBI登录号为：BR001221.1)的DNA序列设计特异性引物；(2)q-LAMP扩增及扩增反应的检测；(3)q-LAMP引物的特异性检测；(4)稻曲病菌孢子的q-LAMP检测。本专利技术的方案具体如下：1、引物的设计：首先专利技术人从NCBI上下载了稻曲病菌的核糖体肽合成酶基因序列，使用primerexplorerV5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计多组引物，然后根据引物所在序列区域的保守性、引本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于稻曲病菌孢子的q‑LAMP快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，其特征在于：所述LAMP特异性引物组合物由上下游外引物、上下游内引物这四条引物组成；上游外引物：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；下游外引物：5’—GAGGATCTTCAAGCACCTTGG—3’；上游内引物：5’—TCTACCCCGCAACTCAGCCCGCGGTTCGTCCGTTTTCG—3’；下游内引物：5’—AGGAGGGGAACTGACACAGGGATTGGCCATGCGTCCATC—3’。

【技术特征摘要】
1.用于稻曲病菌孢子的q-LAMP快速检测方法的LAMP特异性引物组合物，其特征在于：所述LAMP特异性引物组合物由上下游外引物、上下游内引物这四条引物组成；上游外引物：5’—CGGCCCTTATACCCCATTC—3’；下游外引物：5’—GAGGATCTTCAAGCACCTTGG—3’；上游内引物：5’—TCTACCCCGCAACTCAGCCCGCGGTTCGTCCGTTTTCG—3’；下游内引物：5’—AGGAGGGGAACTGACACAGGGATTGGCCATGCGTCCATC—3’。2.用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1所述的LAMP特异性引物组合物。3.根据权利要求2所述的用于定量检测稻曲病菌孢子的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含10×ThermoPolBuffer、1mmol/LdNTPs、4mmol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：张传清，张书亚，李玲，祝倩菲，朱国念，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33