一种结合AUDG和自避分子识别系统的多交叉恒温扩增方法技术方案

本发明专利技术公开了一种结合南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶(AUDG)和自避分子识别系统(SAMRS)的多交叉恒温扩增方法，所述方法对多交叉置换扩增中的引物3’端倒数第二位碱基至倒数第五位碱基的4个碱基进行SAMRS修饰，并在扩增引物C1或C2的5’端标记半抗原，在扩增系统中引入AUDG酶、脱氧尿嘧啶和生物素化的脱氧胞嘧啶，以多交叉置换扩增技术为基础，结合高分子纳米生物传感检测扩增产物。所述方法针对结核分枝杆菌复合群的IS6110特异序列的扩增产物能被高分子纳米生物传感器可视化检测。所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。

A multi cross constant temperature amplification method combined with AUDG and self repellent identification system

The invention discloses a combination of uracil DNA thermal Antarctic glycosylase (AUDG) and self avoiding molecular recognition system (SAMRS) multi cross isothermal amplification method, the method of multiple displacement amplification primers cross 4 of the 3 'end of second countdown countdown to the fifth base base base pair SAMRS modified, and tagged hapten in primers C1 or 5' end of C2, introducing deoxycytosine AUDG enzyme, and biotinylated deoxyuridine in the amplification system, amplification technology based on multi cross replacement, combination of polymer nano bio sensing amplification products. The amplified products of the IS6110 specific sequence of the Mycobacterium tuberculosis complex group can be visualized by a polymer nano biosensor. The method is convenient, fast, sensitive and specific, and is suitable for the detection of various nucleotide fragments.

【技术实现步骤摘要】
一种结合AUDG和自避分子识别系统的多交叉恒温扩增方法
本专利技术公开了一种多交叉置换恒温扩增检测微生物目的基因的方法，属于微生物和分子生物学

技术介绍
在现代生物学和医学领域，核酸扩增是一种不可缺少的技术，已经广泛运用于基础研究、临床诊断、考古研究、流行病研究、转基因研究等领域。在已经发展的核酸扩增技术中，聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)是第一个被建立的体外核酸扩增技术，具有划时代意义，该技术现已被广泛应用于生物相关领域。然而，PCR技术进行核酸扩增时，受到实验室条件的限制，依赖于复杂昂贵的热循环设备。除此之外，PCR产物的检测比较复杂，需要一套复杂的流程及设备。这些劣势限制了该技术的广泛应用，尤其在经济落后的地区及快速诊断领域。因此，对于生物及医学相关研究领域而言，非常有必要发展简单、快速、敏感的核酸扩增方法。为了克服PCR扩增技术的劣势，应运而生了许多恒温扩增技术。与PCR技术比较，恒温扩增技术不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增、现场诊断及便捷检测。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)、滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂、复杂的操作步骤。因此这些恒温扩增方法的实用性、便捷性、可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区。为了克服PCR技术及现有恒温扩增技术的劣势，实现敏感、便捷、快速及特异的扩增核酸序列，专利技术人近期已经建立了一种新的核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(MultipleCrossDisplacementAmplification，MCDA)，相关内容公开于CN104946744A，该专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。MCDA在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。类似于环介导恒温扩增(LAMP)和交叉扩增(CPA)，MCDA的技术瓶颈在结果的判读，即扩增产物的检测。到目前为止，最常见的产物检测手段主要包括颜色指示剂、电泳、实时浊度。然而，这三种检测技术仅仅适用于单重检测(即单一靶标的检测)。此外，颜色指示剂判读扩增产物时，会出现模拟两可的结果，电泳判读结果时耗时较长，容易出现交叉污染，不适合于现场检测，实施浊度判读时需要特殊的仪器设备。为了克服这三种检测技术的劣势，使MCDA技术在生物、医药及卫生领域应用更广泛、更经济。近期，专利技术人以MCDA为基础，将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术、实现快速、敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感的核酸诊断技术(MultipleCrossDisplacementAmplificationlabel-basedgoldNanoparticlesLateralFlowBiosensor，MCDA-LFB)，相关内容公开于CN201610872509.4；CN201610942289.8；CN201610982015.1；CN201710566164.4，这些专利文件作为现有技术文件构成本申请说明书的一个部分。为了将MCDA扩增产物适用于纳米传感技术，传统的策略是在MCDA扩增体系中同时添加两条标记的引物，一条引物在5’端标记生物素，另一条引物在5’端标记半抗原。当MCDA扩增完毕，双标的扩增产物被构建(该双标的产物起源于两条标记的引物)，一端标记生物素，另一端标记半抗原。然而，传统策略构建双标记的MCDA产物会导致假阳性结果，甚至不需要扩增就能导致假阳性结果。该假阳性结果来源于标记引物之间的杂交。因此，为了克服传统标记策略的劣势，本专利技术设计了一种新的检测策略，该技术只需一条标记的引物就能构建双标的扩增产物，从而将扩增产物适用于生物传感技术。为了将MCDA扩增产物适用于生物传感技术的检测，打开反应管是一个必须的步骤，该步骤导致大量的扩增产物以气溶胶的形式挥发，从而导致交叉污染，产生假阳性结果。此外，类似于LAMP和CPA技术，由于技术设计的原因，MCDA会产生假阳性结果，该假阳性结果主要由引物之间的自配、引物内自配或脱靶杂交导致的。为了克服传统标记策略，交叉污染和技术设计导致的假阳性结果，在本专利技术中，专利技术人利用单标记的引物、南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶和自避分子识别系统，以MCDA技术为基础，开发了MCDA结合纳米传感、自避分子识别系统及南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶核酸检测技术[Multiplecrossdisplacementamplificationcoupledwithnanoparticles-basedlateralflowbiosensor(LFB)，self-avoidingmolecularrecognitionsystems(SAMRS)andantarcticthermalsensitiveuracil-DNA-glycosylase(AUDG)forsimultaneousdetectionofnucleicacidsequenceandeliminationofcarryovercontamination；AUDG-SAMRS-MCDA-LFB]。为了验证AUDG-SAMRS-MCDA-LFB技术的可行性，结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTC)被应用于AUDG-SAMRS-MCDA-LFB技术，建立检测MTC的AUDG-SAMRS-MCDA-LFB诊断方法。
技术实现思路
基于上述专利技术目的，本专利技术首先提供了一种多交叉置换恒温扩增结合高分子纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供在3’端倒数第二位碱基至倒数第五位碱基的4个碱基被SAMRS修饰的引物，该修饰可以增加引物的特异性，使引物特异性地与目标模板结合；而且还可以减少引物二聚体的形成及引物内的自体杂交，所述引物包括：置换引物F1和F2，所述置换引物F1的序列如SEQIDNO：1所示，所述置换引物F2的序列如SEQIDNO：2所示；交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQIDNO：3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQIDNO：4所示；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQIDNO：5所示，引物C2的序列如SEQIDNO：6所示；引物D1的序列如SEQIDNO：7所示，引物D2的序列如SEQIDNO：8所示，引物R1的序列如SEQIDNO：9所示，引物R2的序列如SEQIDNO：10所示，同时提供在上述任一引物的5’端标记有半抗原的修饰引物；上述引物是针对目的基因为结核分枝杆菌复合群的IS6110特异序列而设计的。(3)在南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶、链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物、dNTP，以及生物素化的脱氧尿嘧啶存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；(4)使用高分子纳米生物传感器检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多交叉恒温扩增结合高分子纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供在3’端倒数第二位碱基至倒数第五位碱基的4个碱基被SAMRS修饰的引物，所述引物包括：置换引物F1和F2，所述置换引物F1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述置换引物F2的序列如SEQ ID NO：2所示；交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQ ID NO：3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQ ID NO：4所示；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQ ID NO：5所示，引物C2的序列如SEQ ID NO：6所示；引物D1的序列如SEQ ID NO：7所示，引物D2的序列如SEQ ID NO：8所示，引物R1的序列如SEQ ID NO：9所示，引物R2的序列如SEQ ID NO：10所示，同时提供在上述任一引物的5’端标记有半抗原的修饰引物；(3)在南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶、链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物、dNTP，以及生物素化的脱氧尿嘧啶存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；(4)使用高分子纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。...

【技术特征摘要】
1.一种多交叉恒温扩增结合高分子纳米生物传感检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取待检测样品的基因组；(2)提供在3’端倒数第二位碱基至倒数第五位碱基的4个碱基被SAMRS修饰的引物，所述引物包括：置换引物F1和F2，所述置换引物F1的序列如SEQIDNO：1所示，所述置换引物F2的序列如SEQIDNO：2所示；交叉引物CP1和CP2，所述交叉引物CP1的序列如SEQIDNO：3所示，所述交叉引物CP2的序列如SEQIDNO：4所示；提供扩增引物C1和C2，D1和D2，R1和R2，引物C1的序列如SEQIDNO：5所示，引物C2的序列如SEQIDNO：6所示；引物D1的序列如SEQIDNO：7所示，引物D2的序列如SEQIDNO：8所示，引物R1的序列如SEQIDNO：9所示，引物R2的序列如SEQIDNO：10所示，同时提供在上述任一引物的5’端标记有半抗原的修饰引物；(3)在南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶、链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物、dNTP，以及生物素化的脱氧尿嘧啶存在下，使用待检测样品的基因组核酸作为模板恒温扩增DNA；(4)使用高分子纳米生物传感器检测步骤(3)的扩增产物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在5’端标记有半抗原的修饰引物为扩增引物C1。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述在5’端标记的半抗原为荧光素。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子纳米生物传感器包括一背板(1)，在所述背板(1)上依次设置装有样品板(2)、结合板(3)、硝酸纤...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶长芸，王毅，王艳，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京,11