一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法技术

本发明专利技术公开了一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法，该方法为将荧光标记的目标DNA双链、甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；记录检测过程中的荧光值即可。本发明专利技术建立了DNA甲基化过程的无损检测方法，不涉及甲基化以外的任何反应，检测结果最接近待测物的真实状态；对特异位点的甲基化研究具有普适性；无需二次标记或二次反应的检测方法，具有操作步骤简化，分析时间短，测定成本低的特点。

A high throughput on-line detection method for the dynamic process of DNA methylation

High throughput on-line detection method of the invention discloses a DNA methylation dynamic process, this method will be a mixture of target DNA fluorescence labeled double stranded, methyltransferase, methyl transferase substrates and buffer solution were detected by quantitative PCR instrument, detection procedure is 36 to 38 DEG C, 6 ~ 8min, 48 C ~ 50, 2.5 ~ 3.5min; at least 10 cycles; fluorescence values in the detection process can be recorded. The invention establishes a nondestructive detection method of DNA methylation, the methylation reaction does not involve any other than the detection results close to the true state of the object to be measured; universality of methylation specific sites; detection method needs two times or two times mark reaction, with simplified operation steps determination, short analysis time, low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法
本专利技术涉及一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法。
技术介绍
DNA甲基化是指DNA在甲基转移酶(如DNMT3a)作用下，催化底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，转移一个甲基至胞嘧啶的C5位置，生成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的过程。作为重要的表观遗传学修饰方式之一，DNA甲基化与基因遗传和胚胎发育密切相关，也是肿瘤等疾病的潜在标志物。DNA的甲基化修饰方式和程度与MTases的作用方式和活性密切相关。研究DNA甲基化机制和分析方法，对于深入理解表观遗传机制、细胞生长过程和重大疾病诊断具有重要意义。DNA甲基化的分析方法分为基因组整体甲基化水平分析，特异位点甲基化分析，以及新甲基化位点寻找等，常规方法包括甲基化特异性PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的单核苷酸引物扩增(MS-SNuPE)、重亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化敏感性斑点分析(MS-DBA)、限制性标记基因组扫描(RLGS)、甲基化免疫沉淀(MIP)等。虽然这些方法已被广泛应用于临床和基础研究，但多数方法操作繁琐、耗时长、检测成本高或依赖复杂设备。更为重要的是，这些方法只能对DNA甲基化的存在与否进行检测，无法对DNA甲基化的生成过程进行有效分析。实现动态甲基化过程的在线检测，对于加深甲基化过程机制的理解，精确研究甲基化转移酶活性、酶抑制剂、酶序列偏好性等具有重要意义。当前，尚无在线检测动态DNA甲基化过程的有效方法。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本方法基于甲基转移酶在不同温度下的活性差异，结合特定的控温方式，建立一种快速、简便的DNA甲基化动态在线检测方法，同时，利用荧光定量PCR仪实现DNA甲基化动态过程的高通量检测。结果表明，在不同温度条件下，甲基转移酶可以对目标DNA进行“吸附-脱附”的循环作用，消除非特异性干扰，实现DNA甲基化过程的无损在线检测，样本测试值与标准测试值的吻合度为92.07％。本专利技术的目的在于提供一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法，包括以下步骤：将荧光标记的目标DNA双链、甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；记录检测过程中的荧光值。进一步的，步骤1)中，所述DNA双链的终浓度为300～800nM。进一步的，步骤1)中，所述甲基转移酶浓度为100～200nM。进一步的，步骤1)中，所述甲基转移酶底物的终浓度为100～200μM。进一步的，荧光标记的目标DNA双链中荧光标记的位点情况为：其中一条DNA单链的荧光标记在甲基化位点向3’端方向的3bp以内的核苷酸上，另一互补DNA序列的荧光标记在3’端，两处标记的荧光相同。进一步的，步骤1)中，所述缓冲液中含有45～55mMNaCl，8～12mMTris-HCl，8～12mMMgCl2，0.8～1.2mMDTT。进一步的，所述甲基转移酶选自DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L、DNMT1中至少一种。一种甲基化转移酶活性的检测方法，包括以下步骤：将荧光标记的含甲基化位点的DNA双链、待测甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；记录检测过程中的荧光值；根据荧光值的变化情况判断甲基化转移酶活性。一种甲基化转移酶序列偏好性的检测方法，将用荧光标记的待测DNA双链序列、待测甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；记录检测过程中的荧光值；根据荧光值的变化情况，判断甲基化转移酶对不同DNA双链序列的偏好性。一种甲基化转移酶抑制剂的筛选方法，将荧光标记的含甲基化位点的DNA双链、甲基转移酶、待测甲基转移酶抑制剂、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；记录检测过程中的荧光值；根据荧光值的变化情况，判断待测甲基转移酶抑制剂是否对甲基化转移酶具有抑制作用。本专利技术的有益效果是：本专利技术方法通过调控DNA甲基化反应的体系温度，调节甲基转移酶的作用状态，使其在特定的时间进行“吸附-脱附”过程，既保证了甲基化反应的持续性，也极大的减少了非特异性干扰。该方法具有快速、便捷、高通量和使用成本低等特点，在DNA甲基化检测方面具有独特优势：(1)建立了DNA甲基化过程的无损检测方法，该方法不涉及甲基化以外的任何反应，检测结果最接近待测物的真实状态；(2)建立了免限制性生物类或荧光类识别物的检测方法，对特异位点的甲基化研究具有普适性；(3)建立了无需二次标记或二次反应的检测方法，具有操作步骤简化，分析时间短，测定成本低的特点。附图说明图1为本专利技术实验原理示意图；图2为DNA甲基化对FRET效果的影响；A为正常DNA杂交前后的信号变化；B.甲基化DNA杂交前后的信号变化；图3为甲基转移酶DNMT3a在不同温度下作用所产生的FRET信号差异分析；图4为甲基转移酶DNMT3a吸附时间对FRET信号的影响，(甲基转移酶脱附时间3分钟)；a.吸附时间3分钟；b.吸附时间5分钟；c.吸附时间7分钟；d.吸附时间9分钟；图5为甲基转移酶脱附时间对FRET信号的影响(甲基转移酶吸附时间7分钟)；a.脱附时间1分钟；b.脱附时间3分钟；c.脱附时间5分钟；d.脱附时间7分钟；图6为DNA甲基化过程的在线检测结果；A.单一样本；B.多组分样本；图7为DNA甲基化过程的离线检测。具体实施方式一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法，包括以下步骤：将荧光标记的目标DNA双链、甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；记录检测过程中的荧光值。优选的，步骤1)中，所述DNA双链的终浓度为300～800nM。优选的，步骤1)中，所述甲基转移酶浓度为100～200nM。优选的，步骤1)中，所述甲基转移酶底物的终浓度为100～200μM。优选的，荧光标记的目标DNA双链中荧光标记的位点情况为：其中一条DNA单链的荧光标记在甲基化位点向3’端方向的3bp以内的核苷酸上，另一互补DNA序列的荧光标记在3’端，两处标记的荧光相同。优选的，步骤1)中，所述缓冲液中含有45～55mMNaCl，8～12mMTris-HCl，8～12mMMgCl2，0.8～1.2mMDTT。优选的，所述甲基转移酶选自DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L、DNMT1中至少一种。优选的，步骤1)中，所述甲基转移酶底物为S-腺苷甲硫氨酸。一种甲基化转移酶活性的检测方法，包括以下步骤：将荧光标记的含甲基化位点的DNA双链、待测甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测程序为36～38℃、6～8min，48～50本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将荧光标记的目标DNA双链、甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；记录检测过程中的荧光值。

【技术特征摘要】
1.一种DNA甲基化动态过程的高通量在线检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将荧光标记的目标DNA双链、甲基转移酶、甲基转移酶底物和缓冲液的混合物用定量PCR仪进行检测，检测的程序为36～38℃、6～8min，48～50℃、2.5～3.5min；至少10个循环；记录检测过程中的荧光值。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述DNA双链的终浓度为300～800nM。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述甲基转移酶浓度为100～200nM。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述甲基转移酶底物的终浓度为100～200μM。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，荧光标记的目标DNA双链中荧光标记的位点情况为：其中一条DNA单链的荧光标记在甲基化位点向3’端方向的3bp以内的核苷酸上，另一互补DNA序列的荧光标记在3’端，两处标记的荧光相同。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述缓冲液中含有45～55mMNaCl，8～12mMTris-HCl，8～12mMMgCl2，0.8～1.2mMDTT。7.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述甲基转移酶选自DNMT3a、DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴宗，张立，邹小勇，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44