包含mcr基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了包含mcr基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用，属于生物检测技术领域。本发明专利技术的检测用引物及探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑3所示；PCR检测试剂盒，包括荧光PCR检测混合液，所述检测混合液中含有前述的引物和探针。利用本发明专利技术的试剂盒和引物探针能快速检测出包括mcr‑1、mcr‑2共2种mcr高耐药基因的微生物，具有操作简便、灵敏度高、特异性好、准确度高等优点，能够及时发现和确诊可疑病例，提高对各类感染疾病的监测水平。

PCR detection kit for drug resistant bacteria containing MCR gene and its application

The invention discloses a PCR detection kit for the drug resistant bacteria containing the MCR gene and its application, and belongs to the field of biological detection technology. The present invention for detecting nucleotide sequences of primers and probes such as SEQ ID NO:1 3 shows; PCR detection kit, including the detection of mixed liquid fluorescent PCR detection of the mixture containing the primer and probe. By using the reagent kit and primer probe of the invention can quickly detect the including MCR 1 and MCR 2 2 MCR high resistance genes of microorganisms, has the advantages of simple operation, high sensitivity, good specificity, high accuracy, timely detection and diagnosis of suspicious cases, to improve the monitoring level of various infectious diseases.

【技术实现步骤摘要】
包含mcr基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及包含mcr基因的耐药菌的PCR检测试剂盒及其应用，具体涉及一种能够同时快速检测目前所有已知mcr基因型，包括mcr-1、mcr-2的PCR引物、探针及试剂盒，属于生物检测

技术介绍
众所周知，多黏菌素药物是对抗革兰氏阴性菌严重感染的最后一道屏障。然而，随着临床的广泛使用应用，特别是滥用，已经陆续出现了高耐药基因(mcr)，包含mcr基因的微生物将使多黏菌素药物失去作用。迄今，已经发现了两种mcr耐药基因，包括mcr-1和mcr-2，含有这些耐药基因的微生物将对多粘菌素类抗生素失去敏感性。到目前为止，临床对包含mcr基因的耐药菌的检测仍然主要是通过对标本进行选择性培养计数菌落数后，再通过传统药敏试验和PCR扩增并与标准文库对比。随着分子生物学的发展以及分子生物学技术在微生物的应用，特别是荧光PCR技术出现，由于其具有省时省力、敏感性高、特异性强、操作简单快速等特点，且不受试验时间限制，而被广泛应用于临床诊断、疾病研究和病原体检测等方面。然而，迄今使用PCR鉴别诊断mcr耐药菌的方法仍然非常复杂，不仅耗时、费力，而且准确度并不比传统的药敏试验更佳，特别是，迄今已经有2种mcr基因型被发现，现有的mcr耐药菌检测试剂盒都是只能够检测单一的耐药基因，例如只能够检测mcr-1耐药基因，导致确切一一鉴别2种不同mcr基因型具有效率低、成本高的缺陷。因此，寻找一种能有效鉴别产各种mcr的“超级细菌”的方法已经迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鉴别并诊断各种包含mcr基因的耐药菌的荧光PCR检测试剂盒及其制备方法、检测方法，可用于检测并诊断包含mcr基因的耐药菌的感染，用于临床对可疑感染患者进行病原学鉴别诊断。本专利技术的PCR引物、探针及试剂盒能够方便地检测目前已知的所有的mcr耐药基因，不仅简便、快速、准确、灵敏，而且目前国内外尚未见类似的技术报道。本专利技术的第一个目的是提供一种针对各种包含mcr基因耐药菌的检测引物，所述引物包括序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的两条核苷酸序列。在一种实施方式中，所述针对包含mcr基因耐药菌的检测引物的组成如下：上游引物：5’-GGCACATCGACGGCGTAT-3’(SEQIDNO：1)下游引物：5’-GGTATTTGGCGGTATCGACATC-3’(SEQIDNO：2)。本专利技术的第二个目的是提供一种包含mcr基因耐药菌的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括本专利技术的检测引物。在一种实施方式中，所述检测试剂盒中，还包括序列如SEQIDNO：3所示探针。在一种实施方式中，所述探针的一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭基团。在一种实施方式中，所述探针的5’端包括荧光报告基团，3’端包括荧光淬灭基团。在一种实施方式中，所述探针为5’-荧光报告基团-GTGCCGTGTATGTTCAG-荧光淬灭基团-3’(SEQIDNO：3)。在一种实施方式中，所述荧光报告基团为FAM、VIC、ROX、Cy5、JOE或者Quasar705荧光基团中的任意一种。在一种实施方式中，所述荧光淬灭基团为BHQ或者ECLIPSE系列。在一种实施方式中，所述检测试剂盒中还包括普通PCR或者荧光PCR扩增用的PCRbuffer和H2O。在一种实施方式中，所述PCRMIX中含有优化的双阳离子缓冲液、dNTPS、PCR增强剂、PCR稳定剂。在一种实施方式中，所述检测试剂盒中还包括PCR酶、阴性对照品及阳性对照品中的至少一种。在一种实施方式中，所述酶为DNA聚合酶，比如taqDNA聚合酶。在一种实施方式中，所述阳性对照品为灭活或减毒阳性菌株的DNA或相应的对照质粒。在一种实施方式中，所述阴性对照品为DEPC-H2O。在一种实施方式中，所述检测试剂盒为荧光检测试剂盒，包括本专利技术的引物、探针、qPCRmastermix、taqDNA聚合酶。优选地，还包括水或TE。本专利技术的第三个目的是提供所述的检测引物在制备包含mcr基因的耐药菌检测试剂中的应用。本专利技术的第四个目的是提供包含mcr基因耐药菌的检测方法，是利用本专利技术的所述引物或者检测试剂盒进行检测。在一种实施方式中，所述耐药菌为以下任意一种或多种：鲍氏不动杆菌Acinetobacterbaumannii，产气肠杆菌Enterobacteraerogenes，阴沟肠杆菌Enterobactercloacae，大肠杆菌Escherichiacoli，奥克西托克雷白杆菌KlebsiellaOxytoca，臭鼻克雷白氏杆菌Klebsiellaozaenae，肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae，摩根(氏)菌Morganellamorganii，奇异变形杆菌Proteusmirabilis，雷氏普罗威登斯菌Providenciarettgeri，铜绿假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，粘质沙雷氏菌Serratiamarcescens，念珠菌Candidaspecies。在一种实施方式中，所述检测方法，是采用荧光PCR进行检测。在一种实施方式中，荧光PCR扩增体系包括(20μl体系)：8～12μl的qPCRmastermix(2X)、一定浓度的引物和探针、0.1～1μl的taqDNA聚合酶、一定浓度的待测品、其余为水。在一种实施方式中，荧光PCR扩增体系为：10μl的qPCRmastermix(2X)，1μl的引物探针混合液，0.3μl的taqDNA聚合酶，待检DNA模板5μl，加灭菌去离子水补足体积到20μl。在一种实施方式中，荧光PCR扩增体系制备方法如下：取10μl的qPCRmastermix(2X)，与1μl的MCR引物探针混合液和3.7μl的H2O混合，再加入0.3μl的taqDNA聚合酶，取15μl上述混合液加入5μl待测DNA样本，获得反应总体系为20μl的PCR反应液。在一种实施方式中，所述PCR酶由0.3μlTaq酶(5U/μl)，无尿嘧啶-N-糖基化酶制成。在一种实施方式中，所述的MCR引物探针混合液由等体积的10pmol/μl的MCR上游引物、10pmol/μl的MCR下游引物和5pmol/μl探针组成。在一种实施方式中，所述待测品为样本的DNA模板溶液、阳性对照品或阴性对照品(DEPC-H2O)。在一种实施方式中，所述阳性对照品中，对照质粒可以单独包装也可以混合包装。本专利技术针对鉴别并诊断包含mcr基因的耐药菌的荧光PCR检测的试剂盒所用的方法，采用的是Taqman荧光定量PCR原理，分别针对mcr耐药基因设计特异性引物，扩增特异性核酸序列，同时分别设计Taqman探针，并标记不同的荧光报告基团，并位于上下游引物之间。探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记非荧光淬灭基团。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。因此，本专利技术采用的荧光定量PCR技术具有实时检测、定量和高通量检测等特点，且操作简便、灵敏度高、特异性好等优点。使用本专利技术针对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测引物，其特征在于，所述引物包括序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的两条核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种检测引物，其特征在于，所述引物包括序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的两条核苷酸序列。2.一种含mcr基因耐药菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括权利要求1所述的检测引物。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括序列如SEQIDNO：3所示的探针。4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针的一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭基团。5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM、VIC、ROX、Cy5、JOE或者Quasar705荧光基团中的任意一种；所述荧光淬灭基团为BHQ或者ECLIPSE系列。6.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有PCRMIX和H2O。7.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括PCR酶、阴性对照品及阳性对照品中的至少一种。8.权利要求1所述的检测引物在制备包含mcr基因的耐药菌检测试剂中的应用。9.一种含...

【专利技术属性】
技术研发人员：马静静，
申请(专利权)人：北京紫萌医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11