单个甲藻孢囊分子鉴定的方法技术

一种单个甲藻孢囊分子鉴定的方法，包括：获取甲藻孢囊破碎液；以其为模板，以序列为GTCCGCCCTCTGGGTG的核苷酸为外引物上游引物，以序列为TCGCAGTAGTSYGTCTTTAAC的核苷酸为外引物下游引物，进行第一PRC扩增，获取第一扩增产物，以根据第一扩增产物确定甲藻孢囊的物种。若第一扩增产物经电泳检测条带弱不适宜测序，则以序列GTCCGCCCTCTGGGTG的核苷酸为内引物上游引物，以序列为TCGCAGTAGTSYGTCTTTAAC的核苷酸为内引物下游引物进行第二PRC扩增、测序、确定物种。采用该技术方案无需核酸提取，无需孢囊萌发就能快速而准确地对单个甲藻孢囊进行分子鉴定。

Method for identification of monospora monospora

Including the method, a single molecular identification of dinoflagellate cysts: obtaining dinoflagellate cyst crushing liquid; used as templates in the GTCCGCCCTCTGGGTG sequence as primer nucleotide sequence TCGCAGTAGTSYGTCTTTAAC upstream primer, with nucleotide as outer primers and downstream primers, the PRC amplification, obtaining the first amplification products, according to the the first PCR products to determine the dinoflagellate cyst species. If the first expansion product is weak and unsuitable for sequencing, the nucleotide sequence of GTCCGCCCTCTGGGTG is primer primer, and the nucleotide sequence TCGCAGTAGTSYGTCTTTAAC is primer primer. The primers are amplified, sequenced, and identified by second PRC. Without the need of nucleic acid extraction and without the germination of spores, the molecular identification of individual cyclosporin can be carried out quickly and accurately without the germination of the spores.

【技术实现步骤摘要】
单个甲藻孢囊分子鉴定的方法
本专利技术属于单个甲藻孢囊分子鉴定技术，具体涉及单个甲藻孢囊的分离、单个甲藻孢囊的清洗、单个甲藻孢囊的破碎、孢囊破碎液的转移、PCR扩增的技术方法。
技术介绍
甲藻孢囊是甲藻生活史的一个重要阶段，其不仅能促进赤潮的爆发，也能帮助甲藻种度过不利的环境。根据对生态、经济及人类的健康所产生的影响，可将甲藻孢囊分为有害甲藻孢囊(大部分亚历山大藻属)和无害甲藻孢囊(大部分原多甲藻类)。而根据是否产毒素，又可将有害甲藻孢囊分为有害产毒素甲藻孢囊(如塔玛亚历山大藻孢囊、具刺膝沟藻孢囊及利玛原甲藻孢囊等)和有害非产毒素孢囊(可引起赤潮，如锥状斯氏藻、科夫多沟藻及无纹多沟藻等)。根据所含毒素的类型及对人类所造成危害的差别，可将有害产毒素的甲藻孢囊分为不同的类型，如塔玛亚历山大藻孢囊所含的毒素(PSP)可引起人出现四肢麻木、语言障碍等麻痹症状，利玛原甲藻所包含的毒素(NSP)可引起人类的腹泻等。所以甲藻孢囊的准确鉴定至关重要，其不仅有利于有害赤潮的监测以减少有害赤潮所带来的危害，也有利于甲藻多样性的研究。甲藻孢囊的鉴定主要分为形态学鉴定及分子生物学鉴定。形态学鉴定包括孢囊的形本文档来自技高网...

【技术保护点】
单个甲藻孢囊分子鉴定的方法，其特征是，包括：获取甲藻孢囊破碎液；以所述甲藻孢囊破碎液为模板，以序列为GTCCGCCCTCTGGGTG的核苷酸为外引物的上游引物，以序列为TCGCAGTAGTSYGTCTTTAAC的核苷酸为外引物的下游引物，进行第一聚合酶链式反应扩增，获取第一扩增产物，以根据所述第一扩增产物确定所述甲藻孢囊的物种。

【技术特征摘要】
2016.11.17 CN 20161100371581.单个甲藻孢囊分子鉴定的方法，其特征是，包括：获取甲藻孢囊破碎液；以所述甲藻孢囊破碎液为模板，以序列为GTCCGCCCTCTGGGTG的核苷酸为外引物的上游引物，以序列为TCGCAGTAGTSYGTCTTTAAC的核苷酸为外引物的下游引物，进行第一聚合酶链式反应扩增，获取第一扩增产物，以根据所述第一扩增产物确定所述甲藻孢囊的物种。2.根据权利要求1所述的单个甲藻孢囊分子鉴定的方法，其特征是，根据所述第一扩增产物确定所述甲藻孢囊的物种，包括：对所述第一扩增产物进行测序，以确定所述甲藻孢囊的物种。3.根据权利要求1所述的单个甲藻孢囊分子鉴定的方法，其特征是，进行所述第一聚合酶链式反应扩增时，聚合酶链式反应体系配比如下：所述甲藻孢囊的破碎液10微升，缓冲液2.5微升，镁离子2.0微升，所述外引物的上游引物20纳克，所述外引物的下游引物20纳克，Tag酶1.5U。4.根据权利要求1或2或3所述的单个甲藻孢囊分子鉴定的方法，其特征是，进行所述第一聚合酶链式反应扩增，包括：步骤一：扩增温度为95℃，扩增时间为5分钟；步骤二：依次按照以下参数进行聚合酶链式反应扩增循环，循环次数为30次：扩增温度95℃、扩增时间30秒，扩增温度57℃、扩增时间45秒，扩增温度72℃、扩增时间60秒；步骤三：扩增温度72℃、扩增时间7分钟；即得所述第一扩增产物。5.根据权利要求1或2或3所述的单个甲藻孢囊分子鉴定的方法，其特征是，在获取第一扩增产物之后，还包括：对所述第一扩增产物采用质量含量为2％的琼脂或琼脂糖进行凝胶电泳反应，观测反应物，如果反应物的条带不满足预定要求，则还包括：以序列为GTCCGCCCTCTGGGTG的核苷酸为内引物上游引物，以序列为TCGCAGTAGTSYGTCTTTAAC的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：董燕红，战爱斌，高养春，方宏达，李海涛，
申请(专利权)人：国家海洋局南海环境监测中心，中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：广东,44