一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒制造技术

本发明专利技术属生物技术领域，具体涉及检测苯丙酮尿症致病基因是否发生突变的试剂盒。该试剂盒的主要成分包括：(1)PAH基因第1到第13外显子区PCR扩增与测序引物13对；(2)PCR扩增试剂；(3)PCR产物纯化试剂；(4)DNA测序试剂。本发明专利技术的试剂盒用于检测苯丙酮尿症致病基因PAH基因的突变体，可以快速方便地查出致病基因的携带者以及病人，有助于用于产前诊断、及早阻止患儿出生，降低苯丙酮尿症的发病率。

A kit for detecting the mutation of the pathogenic gene of phenylketonuria

The invention belongs to the field of biological technology, in particular to a kit for detecting the mutation of the pathogenic gene of phenylketonuria. The main components of the kit include: (1) PAH gene first to thirteenth exon PCR amplification and primer 13 pairs; (2) PCR amplification reagent; (3) PCR product purification reagent; (4) DNA sequencing kit. The kit of the invention is used for detecting the mutant of PAH gene of phenylketonuria, and it can quickly and conveniently detect the carrier of the pathogenic gene and the patient. It is helpful for prenatal diagnosis, early preventing the birth of the child, and decreasing the incidence of phenylketonuria.

【技术实现步骤摘要】
一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒
本专利技术属生物
，具体涉及检测苯丙酮尿症致病基因是否发生突变的试剂盒。
技术介绍
现有技术公开了苯丙酮尿症(Phenylketonuria,PKU)是一种遗传代谢病，由挪威的Folling医生于1934年发现，因患者尿液中含有大量的苯丙酮酸而得名。研究显示该疾患是由于体内苯丙氨酸羟化酶(PAH)活性降低或其辅酶四氢生物喋吟缺乏，导致苯丙氨酸向酪氨酸代谢受阻，血液和组织中苯丙氨酸浓度增高，尿中苯丙酮酸、苯乙酸和苯乳酸显著增加，称为“苯丙酮尿症”。调查显示该疾患虽为遗传代谢病，但并不少见，我国PKU患病率约为1:10000，美国约为1:14000，北爱尔兰约为1/4400，德国约为1:7000，日本约为1:784000。目前PKU分为两种类型：经典型PKU和BH4缺乏型PKU；其中经典型PKU占99％，是由于染色体基因突变导致肝脏中PAH缺陷而引起苯丙氨酸代谢障碍所致。研究报道了人类PAH基因定位于染色体12q22-24.1全长约90Kb，成熟mRNA长约2.4Kb，共有13个外显子和12个内含子，编码由451个氨基酸组成的酶单体。迄今，在PAH基因上发现了大约567个致病突变(http://www.pahdb.mcgill.ca/cgi-bin/pahdb)，其中点突变在85％以上，有研究在中国人群中发现44种PAH的致病突变类型；其中PAH基因突变导致PAH相应氨基酸的改变，形成不稳定的PAH酶蛋白或降低酶的活性；或甚至突变成终止密码子，导致PAH酶的缺失。研究显示，PAH基因突变具有以下特点：(1)突变位置多变：所有外显子、内含子，5/-UTR和3/-UTR区均发现突变，突变不能单从CpG位点解释；(2)突变类型多样：有错义突变、小缺失、剪接位点突变等，但大部分是错义突变；(3)突变呈现明显的异质性：不同种族和地区人群之间PAH基因座突变部位及分布具有较大差异。还有研究显示，PKU是单基因突变且大部分是复合杂合子，因此大部分PAH基因必然有两个等位基因突变。目前，本领域学者在致力寻找PAH的高频突变等位基因，以探索PKU的基因诊断、产前诊断及携带者检查，如，Guldberg1996年研究美国PKU患者发现高频突变等位基因为R408W(18.7％)；波兰PKU基因突变高频位点为A403G和R297H；Yoshiyuki研究41例日本PKU，发现高频突变位点为R413P和R243Q。Johannes检测546例PKU，其中411例德国人，65例土耳其人，发现91种突变，最常见的突变是R408W(22％)，并指出欧洲PAH基因突变有明显地区差异，如南欧常见突变为IVS10-11G>A东欧为R408W、(巴厘岛占80％以上)、北欧为IVS12+1G>A(丹麦占37％)或R408W(爱尔兰占42％)。Judith检测西班牙115例PKU和268名亲属，发现57种不同类型的突变。还有临床表型和基因型研究报道R408W纯合子是经典型PKU，R261Q纯合子是中间型PKU；R408W复合杂合子表型取决于其他等位基因的突变类型，R408W/IVSnt-1，R408/R261X表现为经典型PKU，R408W/R252W表现为轻型PKU，R408W亦可见于良性高苯丙氨酸血症；Desviat检测古巴的28例PKU病人，发现古巴PKU患者的突变热点为E208K和R261Q；Giannattasio检测分析意大利PKU患者的289条染色体，发现基因突变具有地区差异，IVS10nt-11G>A和R261Q是意大利PKU患者的突变热点。目前国内外对苯丙酮尿症患儿的诊断方法主要有尿三氯化铁试验、血清苯丙氨酸浓度测定、尿蝶呤分析、Guthrie细菌抑制试验。实践显示，所述生化检测的方法耗时长且繁琐，而且仅适用与已经出生的婴儿，对产前诊断无能为力。尤其对已生育过苯丙酮尿症患儿的家庭，再次怀孕生育苯丙酮尿症患儿的概率为25％，盲目生育导致悲剧发生的可能性极大。业内共识，由于苯丙酮尿症的致病基因(苯丙氨酸羟化酶基因)仅在肝脏和肾脏中表达，基因诊断成为早期诊断的最有效的手段。有关研究开始对PKU患者的筛查和临床检验，如单链多态性PCR检测(PCR-SSCP)、等位基因特异性寡核苷酸杂交法(PCR-ASO)、限制性内切酶的酶切(PCR-RFLP)、等位基因特异性扩增(ARMS)、短串联重复序列(PCR-STR)及高压液相色谱定量(HPLC)法且已经应用于临床，为PKU的早期诊断和早期治疗提供检验学依据和基础。基于现有技术的现状和基础，本申请的专利技术人拟提供检测苯丙酮尿症致病基因是否发生突变的试剂盒。进一步为苯丙酮尿症产前诊断提供有效措施。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，具体涉及一种采用DNA测序技术检测苯丙酮尿症致病基因PAH基因是否突变的试剂盒。本专利技术基于PKU的遗传方式为常染色体隐性遗传，先证者父母为携带者，即携带有一个PKU致病突变位点的杂合子，携带者无PKU临床症状；先证者的同胞有1/4的风险患病，1/2的风险成为PKU致病突变携带者，并有1/4的可能性为不带有PKU致病突变的正常人；PKU家庭若要再次生育，需要有基因检测的保证，需进行产前基因诊断；先证者的后代肯定为携带者；若携带者频率为1/50，PKU患者的后代为患者的可能性为1/100，先证者父母的同胞为携带者的可能性为1/2等研究基础，采用一代测序技术对PKU患者PAH基因进行突变检测，检测区域覆盖PAH基因全部13个外显子区域及外显子-内含子交界区(如图1所示)，经应用与产前诊断中，结果表明，经过上述流程明确先证者及其父母的致病突变后，明显有助于作出产前诊断。更具体的，本专利技术提供了一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，该试剂盒的主要成分包括：(1)PAH基因第1到第13外显子区PCR扩增与测序引物13对，引物序列如表1所示；(2)常规PCR扩增试剂，如dNTP、TaqDNA聚合酶等；(3)常规PCR产物纯化试剂，如SAP酶、ExoI酶等；(4)常规DNA测序试剂，如BigDyemix、EDTA溶液、乙醇溶液、HI-DI溶液等。表1PAH基因第1-13外显子区的PCR扩增与测序引物序列所述引物序列扩增出的DNA序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的试剂盒通过下述方法用于检测苯丙酮尿症致病基因PAH基因的突变体，包括以下步骤：(1)提取样本的基因组DNA；(2)PAH基因PCR扩增针对PAH基因第1-13外显子区按照表2设计引物进行PCR扩增。每个反应体系为总体积16u1，包含Taq酶混合液7.5μL(dNTP、10×PCR反应缓冲液、MgCl2)、去离子水5.5μL、引物对(l0uM)1μL、基因组DNA(100ng/ul)1ul。反应条件为95℃15分钟，进行14个循环(-0.5℃/循环)的94℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；然后进行30个循环的94℃30秒，56℃30秒，72℃45秒，最后进行72℃10分钟。(3)PCR产物纯化每个反应体系总体积为5.6μL。PCR产物4μL，再加入1.6μLSAP酶混合物(SAP酶、ExoI酶、去离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，其包括以下成分:PAH基因第1到第13外显子区PCR扩增与测序引物13对、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；所述引物序列为：

【技术特征摘要】
1.一种检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，其包括以下成分:PAH基因第1到第13外显子区PCR扩增与测序引物13对、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂、DNA测序试剂；所述引物序列为：2.如权利要求1检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，所述引物序列扩增出的DNA序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1检测苯丙酮尿症致病基因突变的试剂盒，其特征在于，通过下述检测苯丙酮尿症致病基因突变，(1)提取样本的基因组DNA；(2)PAH基因PCR扩增；采用权利要求1所述引物序列；每个PCR扩增体系总体积为16μL，包含Taq酶混合液7.5μL、去离子水5.5μL、引物对1μL、基因组DNA1ul；PCR反应条件为95℃15分钟，进行14个循环的94℃30秒，63℃30秒，72℃45秒；然后进行30个循环的94℃30秒，56℃30秒，72...

【专利技术属性】
技术研发人员：向天敏，徐沁，梅艳巧，景丹丹，
申请(专利权)人：海门中科基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32