一种浮游动物标准品及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种浮游动物标准品及其制备方法。本发明专利技术浮游动物标准品的制备方法包括以下步骤：(1)将采集的浮游动物样品分成两份，其中一份用甲醛溶液固定，另一份用无水酒精固定；(2)通过形态鉴定，对步骤(1)中已固定的两份浮游动物样品按种类进行分选；(3)取分选后的经无水酒精固定的浮游动物样品，测定其DNA条形码序列并进行比对，确认步骤(2)分选所得的浮游动物的种类；(4)将步骤(2)分选后的经甲醛固定的浮游动物样品进行分装和配制，得到浮游动物标准品。本发明专利技术将DNA条形码技术引入浮游动物标准品的制备中，采用DNA条形码技术对其进行鉴定，以保证标准品的真实、可靠，采用本发明专利技术方法制备的浮游动物标准品准确性更高。

【技术实现步骤摘要】
一种浮游动物标准品及其制备方法
本专利技术涉及一种标准品及其制备方法，具体涉及一种浮游动物标准品及其制备方法。
技术介绍
海洋浮游动物是海洋生物资源调查、海洋生态环境监测的重要对象之一。目前，全国绝大多数海洋环境监测机构开展了浮游动物的监测工作。数据的准确性是环境监测工作的生命线，监测人员的素质和专业水平是确保数据准确性的关键因素。然而，与一些化学污染物，如营养盐、重金属等相比，国内在海洋生物监测中至今没有标准品，使得不同实验室间无法开展比测，新进人员也无法通过标准品的考核取得相应的上岗资质。海洋浮游动物标准品应满足以下几个条件：①标准品包含的种类应具有广布性，即在我国南、北海域均有分布，以便全国的海洋环境监测机构能够同时使用；②标准品包含的种类应尽量涵盖浮游动物的主要类群，如桡足类、水母类、毛颚类等；③标准品中的浮游动物种名要绝对的准确，所有种类的鉴定结果要求准确无误。浮游动物(也包括其他一切生物)鉴定是一项专业性极强的工作，鉴定者通常是比照图谱来确定。然而，出版物的质量良莠不齐，以及鉴定人员的知识水平差异，严重影响了物种鉴定的准确性。此外，当前国内从事海洋浮游动物分类研究的学者极度匮乏，而且专业的分类学家也只专长在某一特定的浮游动物类群，一个人难以对全部浮游动物进行准确的分类和鉴定。我国的海洋浮游动物分类已严重滞后，如张福绥1964年将轮螺科(Architectonicidae)的浮游面盘幼虫定为螔螺科(Limacinidae)强卷螺属(Agadina)的种类，尽管同年Robertson即纠正了分类错误，但时至今日，国内仍然在沿用这一错误的分类名称。全球尺度的浮游动物地理学研究表明，一些种类在我国海域不可能有分布。传统的形态鉴定主观性较强，对鉴定者要求很高，且极大地依赖于个人的经验和水平。而专业的分类学者极其匮乏，且他们大多专长于某一特定的生物类群，故如果采用传统的形态鉴定方法来制备浮游动物标准品，不同的鉴定者对同一份样品进行鉴定很难得出相同的结果。形态学鉴定不仅容易导致物种鉴定错误，也容易导致鉴定出物种的种类数偏少，造成生物多样性被低估，难以保证其质量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种新的浮游动物标准品及其制备方法，该方法制得的标准品准确性更高。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种浮游动物标准品的制备方法，其包括以下步骤：(1)将采集的浮游动物样品分成两份，其中一份用甲醛溶液固定，另一份用无水酒精固定；(2)通过形态鉴定，对步骤(1)中已固定的两份浮游动物样品按种类进行分选；(3)取分选后的经无水酒精固定的浮游动物样品，测定其DNA条形码序列并在数据库中进行比对，确认步骤(2)分选所得的浮游动物的种类；(4)将步骤(2)分选后的经甲醛固定的浮游动物样品进行分装和配制，得到浮游动物标准品。上述步骤(2)中，分选的种类尽量包括浮游动物的主要类群，如桡足类、水母类、毛颚类等，分选的个体数要尽可能多。浮游动物标准品的制备采用分选后的经甲醛固定的浮游动物样品，酒精固定的浮游动物样品分选的数量在10～20只之间。对于一些经酒精固定后变形较大的种类，如部分水母类，应尽量避免用作标准品。分选时要选择发育完全成熟的个体，未发育成熟的个体不能用作标准品的制备。现有技术中，浮游动物标准品是基于传统的形态学来制备，这样主观性强，准确率低。本专利技术制备浮游动物标准品时，采用了DNA条形码技术，DNA条形码技术克服了对经验和水平的过度依赖，能够快速、准确的对浮游动物进行物种鉴定。本专利技术通过将形态学和DNA条形码技术相结合的方法来制备浮游动物标准品，能显著提高标准品的质量，避免形态鉴定的主观性。作为本专利技术所述浮游动物标准品的制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，DNA条形码信息的获取方法包括以下步骤：(a)提取浮游动物样品的总DNA；(b)采用PCR扩增浮游动物样品的线粒体COI基因(细胞色素氧化酶I亚基)或16SrRNA基因；其中，采用PCR扩增线粒体COI基因的引物对如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；采用PCR扩增16SrRNA基因的引物对如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；(c)对PCR产物进行回收纯化和双向测序。作为本专利技术所述浮游动物标准品的制备方法的更优选实施方式，采用DNA提取试剂盒或碱裂解法提取浮游动物样品的总DNA。提取浮游动物样品的总DNA时，可视其个体大小取整只浮游动物或部分组织进行提取。作为本专利技术所述浮游动物标准品的制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，PCR扩增和测序之间还包括以下步骤：采用电泳检测PCR扩增产物。通过电泳，以确认PCR扩增是否成功，并对PCR扩增产物进行回收纯化。作为本专利技术所述浮游动物标准品的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)之前还包括步骤(1a)：采集浮游动物样品。采集时，尽可能多的采集浮游动物样品。作为本专利技术所述浮游动物标准品的制备方法的更优选实施方式，所述步骤(1a)为：采用浅水Ⅰ型浮游生物网或大型浮游生物网，通过垂直拖网和水平拖网相结合的方式采集浮游动物样品。作为本专利技术所述浮游动物标准品的制备方法的优选实施方式，所述甲醛溶液中甲醛的体积浓度为5％。作为本专利技术所述浮游动物标准品的制备方法的优选实施方式，所述无水酒精的用量为需固定浮游动物体积的2～3倍。作为本专利技术所述浮游动物标准品的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，采用体视镜进行形态鉴定。作为本专利技术所述浮游动物标准品的制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，浮游动物样品分装于体积为1.5mL或2.0mL的塑料管中。作为本专利技术所述浮游动物标准品的制备方法的更优选实施方式，每支塑料管中包括20种浮游动物，每种动物1～5只。塑料管中每种动物分装的数量视其个体大小而定，大个体的种类分装数量可少一些，小个体的种类可适当增加数量。不同批次制备的浮游动物标准品种类及数量应尽量不一样，以备重新补考等的需要。另外，本专利技术还提供了上述方法制备所得的浮游动物标准品。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术将DNA条形码技术引入浮游动物标准品的制备中，采用DNA条形码技术对其进行种类鉴定，以保证标准品的真实、可靠，克服了形态鉴定的缺陷。采用本专利技术方法制备的浮游动物标准品准确性更高，有利于海洋环境监测实验室间的相互比测，以及对专业人员的上岗前考核，也能为技术人员的上岗考核提供考核样，有助于海洋环境和资源监测能力的提升。附图说明图1为海洋浮游动物的照片图；图2为异尾宽水蚤标准品的测序峰图。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术浮游动物标准品及其制备方法的一种实施例，本实施例所述浮游动物标准品的制备方法为：(1)浮游动物样品的采集：采用浅水Ⅰ型浮游生物网，通过垂直拖网和水平拖网相结合的方式采集海洋浮游动物样品；(2)浮游动物样品的保存：将采集的浮游动物样品分成两份，其中一份用甲醛溶液固定，另一份用无水酒精固定；甲醛溶液中甲醛的体积浓度为5％，无水酒精的用量为浮游动物体积的2～3倍；(3)浮游动物种类的分选：采用体视镜进行形态鉴定，对步骤(2)中已固定的两份浮游动物样品进行分选；分选时，选择本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种浮游动物标准品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将采集的浮游动物样品分成两份，其中一份用甲醛溶液固定，另一份用无水酒精固定；(2)通过形态鉴定，对步骤(1)中已固定的两份浮游动物样品按种类进行分选；(3)取分选后的经无水酒精固定的浮游动物样品，测定其DNA条形码序列并在数据库中进行比对，确认步骤(2)分选所得的浮游动物的种类；(4)将步骤(2)分选后的经甲醛固定的浮游动物样品进行分装和配制，得到浮游动物标准品。

【技术特征摘要】
1.一种浮游动物标准品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将采集的浮游动物样品分成两份，其中一份用甲醛溶液固定，另一份用无水酒精固定；(2)通过形态鉴定，对步骤(1)中已固定的两份浮游动物样品按种类进行分选；(3)取分选后的经无水酒精固定的浮游动物样品，测定其DNA条形码序列并在数据库中进行比对，确认步骤(2)分选所得的浮游动物的种类；(4)将步骤(2)分选后的经甲醛固定的浮游动物样品进行分装和配制，得到浮游动物标准品。2.如权利要求1所述的浮游动物标准品的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，DNA条形码信息的获取方法包括以下步骤：(a)提取浮游动物样品的总DNA；(b)采用PCR扩增浮游动物样品的线粒体COI基因或16SrRNA基因；其中，采用PCR扩增线粒体COI基因的引物对如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；采用PCR扩增16SrRNA基因的引物对如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示；(c)对PCR产物进行回收纯化和双向测序。3.如权利要求2所述的浮游动物标准品...

【专利技术属性】
技术研发人员：董燕红，李海涛，方宏达，黄彬彬，何静，
申请(专利权)人：国家海洋局南海环境监测中心，
类型：发明
国别省市：广东,44