采用ddPCR方法鉴定PML‑RARα融合基因中的Brc3亚型技术

本发明专利技术公开了一种采用ddPCR方法鉴定PML‑RARα融合基因中的Brc3亚型，该ddPCR方法包括提取血液中的RNA并进行QC评估和RNA反转录cDNA并进行QC评估。本发明专利技术针对常见的Brc3型，设计检测fusion探针，引物针对fusion两侧序列进行扩增；将RARΑ基因作为内参，设计Ref探针，引物仅扩增RARΑ基因。本发明专利技术中的ddPCR检测方法PML‑RARα融合bcr3亚型可达0.01%的丰度，远超RT‑PCR的0.1%，重复性好，无假阳性；在低AF的情况下，建议样本投入量增加，或重复多个平行操作。由于该技术的高灵敏度，因此可应用于疾病的早期确诊、动态监测和防治复发。

DdPCR method was used to identify PML RAR alpha fusion gene of Brc3 subtype

The invention discloses a method for identification of PML RAR alpha fusion gene of Brc3 subtype by ddPCR method, the ddPCR method includes the extraction of RNA in blood and QC evaluation and RNA reverse transcription cDNA and QC evaluation. The invention is based on Brc3 type common design, detection of fusion probes, primers for fusion flanking sequences were amplified; the RAR alpha gene as internal design, Ref probes, primers only amplified RAR gene. The abundance of ddPCR detection method of the invention of PML RAR alpha fusion bcr3 subtype was 0.01%, far more than 0.1% RT PCR, good repeatability, no false positive; in the case of low AF samples suggest the quantity of the input increases or repeated multiple parallel operation. Because of the high sensitivity of the technology, it can be used for early diagnosis, dynamic monitoring and recurrence of disease.

【技术实现步骤摘要】
采用ddPCR方法鉴定PML-RARα融合基因中的Brc3亚型
本专利技术属于基因鉴定方法
，具体的说是涉及一种采用ddPCR方法鉴定PML-RARα融合基因中的Brc3亚型。
技术介绍
PML-RARα融合基因由t(15:17)(q22:q21)易位形成，常见于急性早幼粒细胞白血病(APL)。RARα和PML的fusion具有以下特征：RARα基因断裂位点位于第二内含子；而PML基因有三个区域参与了t(15：17)易位，即内含子6(Brc1，约占55％)、外显子6(Brc3，约占5％)、内含子3(brc3，约占40％)。PML-RARα融合基因根据断裂位点的位置可分为三种亚型：如图1所示,长型(L型、Brc1)、变异型(V型、Brc3)和短型(S型、brc3)。目前白血病的治疗较有效，其病人生存期得到了延长，但后期跟进发现数年内复发率较高，可能原因为目前采用RT-PCR检测技术其检测灵敏度仅为0.1％。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术存在的不足，提供一种具有高灵敏度的采用ddPCR方法鉴定PML-RARα融合基因中的Brc3亚型。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用ddPCR方法鉴定PML‑RARα融合基因中的Brc3亚型，其特征在于：所述ddPCR方法包括提取血液中的RNA及QC评估，具体操作过程如下：（1）提取RNA，将血浆分装在1.5ml EP管中，每管分装300μl；使用天根试剂盒中自带的细胞裂解液CL，加入750μl至血液中，上下颠倒混匀，静置1min；10000rpm离心1min；弃上清，留沉淀；再加入700μl CL至血液中，同等条件下离心，弃上清，留沉淀；（2）加入150μl buffer PKD，吹打混匀；然后加入10μl蛋白酶K，吹打混匀；样本于恒温仪56℃、转速350rpm、15min后迅速置于冰上3min；13400rpm...

【技术特征摘要】
1.一种采用ddPCR方法鉴定PML-RARα融合基因中的Brc3亚型，其特征在于：所述ddPCR方法包括提取血液中的RNA及QC评估，具体操作过程如下：（1）提取RNA，将血浆分装在1.5mlEP管中，每管分装300μl；使用天根试剂盒中自带的细胞裂解液CL，加入750μl至血液中，上下颠倒混匀，静置1min；10000rpm离心1min；弃上清，留沉淀；再加入700μlCL至血液中，同等条件下离心，弃上清，留沉淀；（2）加入150μlbufferPKD，吹打混匀；然后加入10μl蛋白酶K，吹打混匀；样本于恒温仪56℃、转速350rpm、15min后迅速置于冰上3min；13400rpm离心15min，转移上清160μl至1.5mlEP管中；将上清置于恒温仪上80℃孵育15min，13400rpm快速离心30s；加入320μlbufferRLT，吹打混匀，再加入1000μl96～100%乙醇，涡旋混匀；（3）每次转移700μl样本至RNeasyMinElute离心柱中，13400rpm离心15s，弃滤液，重复本步骤直到...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐诗瑶，陆军，
申请(专利权)人：云健康基因科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31