一种采用ddPCR鉴定PML‑RARα融合基因中Brc2亚型的方法技术

本发明专利技术公开了一种采用ddPCR鉴定PML‑RARα融合基因中Brc2亚型的方法，该方法包括提取血液中的RNA并进行QC评估，还包括RNA反转录cDNA并进行QC评估。本发明专利技术ddPCR检测PML‑RARA融合bcr2亚型可达0.01%的丰度，远超RT‑PCR的0.1%，重复性好，无假阳性；在低AF（0.01%）的情况下，建议样本投入量增加，或重复多个平行操作。由于该技术的高灵敏度，因此可应用于疾病的早期确诊、动态监测和防治复发。本发明专利技术针对常见的Brc2型，设计检测fusion探针，引物针对fusion两侧序列进行扩增；将RARA基因作为内参，设计Ref探针，引物仅扩增RARA基因。

A method of using ddPCR PML identification RAR alpha fusion gene in Brc2 subtype

【技术实现步骤摘要】
一种采用ddPCR鉴定PML-RARα融合基因中Brc2亚型的方法
本专利技术属于基因鉴定方法
，具体的说是涉及一种采用ddPCR鉴定PML-RARα融合基因中Brc2亚型的方法。
技术介绍
PML-RARα融合基因由t(15:17)(q22:q21)易位形成，常见于急性早幼粒细胞白血病(APL)。RARα和PML的fusion具有以下特征：RARα基因断裂位点位于第二内含子；而PML基因有三个区域参与了t(15：17)易位，即内含子6(Brc1，约占55％)、外显子6(brc2，约占5％)、内含子3(brc3，约占40％)。PML-RARα融合基因根据断裂位点的位置可分为三种亚型：如图1所示,长型(L型、Brc1)、变异型(V型、brc2)和短型(S型、brc3)。目前白血病的治疗较有效，其病人生存期得到了延长，但后期跟进发现数年内复发率较高，可能原因为目前采用RT-PCR检测技术其检测灵敏度仅为0.1％。基于该检测技术的局限性，本项目采用更加高灵敏的ddPCR方法进行检测，旨在对临床具有指导意义，其灵敏度可达0.01％。
技术实现思路
本专利技术为了克服现有技术存在的不足，提供本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用ddPCR鉴定PML‑RARα融合基因中Brc2亚型的方法，其特征在于：一、该方法包括提取血液中的RNA并进行QC评估，具体操作过程如下：（1）提取RNA，将血浆分装在1.5ml EP管中，每管分装300μl；（2）使用天根试剂盒中自带的细胞裂解液CL，加入750μl至血液中，上下颠倒混匀，静置1min；10000rpm离心1min；弃上清，留沉淀；再加入700μl CL至血液中，同等条件下离心，弃上清，留沉淀；（3）加入150μl buffer PKD，吹打混匀；然后加入10μl蛋白酶K，吹打混匀；勿配置mix，需单独依次加入；（4）样本于恒温仪56℃、转速350rpm、15min后...

【技术特征摘要】
1.一种采用ddPCR鉴定PML-RARα融合基因中Brc2亚型的方法，其特征在于：一、该方法包括提取血液中的RNA并进行QC评估，具体操作过程如下：（1）提取RNA，将血浆分装在1.5mlEP管中，每管分装300μl；（2）使用天根试剂盒中自带的细胞裂解液CL，加入750μl至血液中，上下颠倒混匀，静置1min；10000rpm离心1min；弃上清，留沉淀；再加入700μlCL至血液中，同等条件下离心，弃上清，留沉淀；（3）加入150μlbufferPKD，吹打混匀；然后加入10μl蛋白酶K，吹打混匀；勿配置mix，需单独依次加入；（4）样本于恒温仪56℃、转速350rpm、15min后迅速置于冰上3min；（5）13400rpm离心15min，转移上清160μl至1.5mlEP管中；（6）将上清置于恒温仪上80℃孵育15min，13400rpm快速离心30s；（7）加入320μlbufferRLT，吹打混匀，再加入1000μl96～100%乙醇，涡旋混匀；（8）每次转移700μl样本至RNeasyMinElute离心柱中，13400rpm离心15s，弃滤液，重复本步骤直到将所有样本过柱完毕；（9）加350μlbufferFRN到离心柱，13400rpm离心15s，弃滤液；（10）配mix:10μlDNaseI和70μlbufferRDD，吹打混匀，将其加到离心柱中的膜上，置于室温20～30℃温度下15min；（11）加500...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆军，金安娜，
申请(专利权)人：云健康基因科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31