一种鉴定水稻产生ALS基因突变的四引物分子标记方法技术

本发明专利技术涉及一种鉴定水稻产生ALS基因突变的四引物分子标记方法，属于生物技术工程领域。根据水稻ALS基因在编码区第1642和1643碱基发生TG到AT的变异，设计四条特异性分子标记引物，加入同一PCR反应体系并对不同水稻DNA进行扩增并进行电泳检测，不同大小的DNA条带即代表ALS不同基因型的纯合体和杂合体。本发明专利技术方法不仅能快速、准确的鉴定水稻种质资源或育种群体中出现的抗ALS抑制剂类除草剂的基因变异，而且在育种中能提高对含ALS基因突变纯合基因型的选择效率，加快抗ALS抑制剂类除草剂水稻品种的育种进程。

A four primer molecular marker method for identification of ALS gene mutation in Rice

The invention relates to a four primer molecular marker method for identifying ALS gene mutation in rice, which belongs to the field of biotechnology engineering. According to the rice ALS gene occurred in the encoding region 1642nd and 1643 base TG to AT mutation, four specific molecular markers were added to the same PCR reaction system of different rice DNA were amplified and detected by agarose gel electrophoresis. Different sizes of DNA bands representing different genotypes of ALS homozygote and heterozygote. The method of the invention can not only quickly and anti ALS inhibitors appear herbicide accurate identification of rice germplasm or breeding populations of genetic variation, but also can improve the selection efficiency on ALS containing gene mutation homozygous genotypes in breeding, accelerating the breeding process of anti ALS inhibitor herbicides in rice varieties.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定水稻产生ALS基因突变的四引物分子标记方法一、
本专利技术涉及一种鉴定水稻产生ALS基因突变的四引物分子标记方法，属于生物技术工程领域，专用于抗ALS抑制剂类除草剂水稻品种资源的鉴定和品种选育。二、
技术介绍
随着社会经济的不断发展，农村劳动力大量转移，直播稻作为水稻轻简栽培的一种重要方式，由于省工节本效果明显，深受广大农户的欢迎，种植面积迅速扩大。以江苏省为例，2008年全省直播稻面积高达69.3万hm2，约占水稻总面积的33％(孙统庆等，中国稻米，2014，20(6)：5-9)。近年来，随着机插秧技术的快速推广以及严控直播稻盲目发展措施的落实，其快猛增长的趋势有所遏制，但仍是水稻种植的重要方式。长期以来，田间杂草危害一直是困扰直播稻生产的技术难题，尽管一些商业化的除草剂能有效防治草害发生，但不当施用经常常会对水稻造成不同程度的伤害。因此，培育具有除草剂抗性的水稻品种是防治直播田杂草危害最经济、有效的途径。近年来，各种以乙酰乳酸合成酶(AcetolactateSynthase,ALS)为靶标的除草剂如咪唑啉酮类(Imidazolinones,IMs)、磺酸脲类(Sulfonylureas,SUs)、三唑并嘧啶类(Triazolopyrimidines,TPs)、嘧啶羧酸类(Pyrimidinylcarboxyherbicides,PCs)等，由于具有除草谱广、低毒高效、选择性强等优点，被广泛应用于作物杂草的灭除(曲仁渝等,华中师范大学学报(自然科学版),2015,49(5):735-745)。该类除草剂的作用机理主要是通过与植物体内的乙酰乳酸合酶形成复合物阻断底物进入酶活性位点通路，抑制ALS酶活性，使支链氨基酸如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的合成受阻，导致植物死亡。抗性机制研究表明，植物ALS基因保守区发生错义突变会导致酶结构发生变化，降低对除草剂的亲和力，进而产生抗性(DugglebyRG,etal.,PlantPhysiolBiochem,2008,46:309-324)。美国是最早开展ALS抑制剂类除草剂抗性品种选育的国家。1993年路易斯安那州立大学农业中心利用甲磺酸乙酯(EthylMethanesulfonate,EMS)诱变水稻品种AS3510，M2代喷洒咪唑乙烟酸，筛选出具有咪唑啉酮类除草剂抗性的突变系93AS3510，并进一步与品种Cocodrie和MayBelle杂交，选育出抗性品种CL121与CL141，并于2002年首次在美国进行商业化种植(SudiantoE,etal.,CropProt,2013,49:40-51)。为进一步提高品种的丰产性，该中心利用相同的方法对美国优质籼稻品种Cypress进行诱变，筛选出抗性品系PWC16，并系统选育出品种CL161，并逐步取代CL121和CL141(WenefridaIetal.,CanJPlantSci,2007,87:659-669.)。此后，阿根廷学者也从当地品种IRGA417的EMS诱变后代中筛选出抗性材料并育成品种Puita’Intacl(GoulartICGR,etal.,WeedRes,2012,52:224-232)。分子生物学研究表明，虽然AS3510、PWC16和Puita’Intacl等材料都具有相似的除草剂抗性，但基因的变异位点则完全不同。AS3510的抗性源自ALS基因第654位甘氨酸(Gly,G)转变为谷氨酸(Glu,E)；PWC16的抗性是由第653位丝氨酸(Ser,S)突变为天冬氨酸(Asp,D)造成的；而Puita’Intacl出现抗性则是由第122位缬氨酸(Val,V)到苏氨酸(Thr,T)的变异(GoulartICGR,etal.,WeedRes,2012,52:224-232)。目前，由于上述位点均已申请相关专利，而我国想在此基础上开展商业化育种，不仅会受到国外研究机构的诸多限制，而且还必须承担昂贵的专利使用费。近年来，深圳兴旺生物种业有限公司利用化学诱变的方法处理广东优质常规籼稻品种黄丝占和黄华占，通过苗期大规模咪唑啉酮类除草剂的筛选，获得一些突变体具有新的ALS基因突变位点。研究发现，与野生型相比，其中黄华占突变植株1的ALS基因在编码区第1642和1643碱基发生TG到AT的突变，导致第548位编码氨基酸由色氨酸(Trp,W)突变为甲硫氨酸(Met,M)，进而产生除草剂抗性(陈竹锋，王承旭，柳威，唐晓艳，邓兴旺.中国专利，CN201210037789.9，2013-04-17)，这是我国首次报道在水稻中发现具有自主知识产权的抗ALS抑制剂类除草剂新位点和新材料，它将推动国内相关育种工作的蓬勃开展。利用目标基因存在的碱基差异，开发共显性的功能标记进行辅助选择是提高ALS抑制剂类除草剂抗性品种选育效率的最佳方法。针对已发现的变异位点，Kadaru和Roso等分别利用等位基因特异PCR(Allele-SpecificPCR，AS-PCR)和竞争性等位基因特异性PCR的方法(KompetitiveAlleleSpecificPCR，KASP)，对造成G654E、S653D、A122T氨基酸变异的碱基位点开发相应的分子标记，实现了对上述差异位点准确的鉴定(KadaruS,etal.,Euphytica,2008,160:431-438；RosoAC,etal.,FieldCropsRes,2010,119:175-182；RosasJEetal.,ElectronicJofBiotechn,2014,17:95-101)。然而，传统ASPCR虽然能够避免CAPS(CleavedAmplifiedPolymorphismSequences)标记检测过程中酶切等繁琐的操作，但结果假阴性偏多，且不能对杂合基因型进行一次性检测；而KASP技术尽管具有高通量的特性，但对引物和检测设备的要求较高，国内大多数育种单位目前还难以应用。四引物扩增受阻突变体系PCR技术(Tetra-primerAmplificationRefractoryMutationSystemPCR,Tetra-primerARMS-PCR)是近年来在等位基因特异扩增PCR基础之上发展起来的，专门针对单核苷酸突变一种新的检测方法。通过四条引物的一次PCR扩增、电泳就可以直接达到区分不同基因型的目的，具有快速、简便、费用低等特点，并在水稻分子育种中开始得到广泛应用(陈涛等，中国水稻科学，2013，27(5)：529-534；李军等，中国水稻科学，2014，28(4)：442-446)。其技术原理是依据TaqDNA酶聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，对于3′末端错配的引物，以低于正常末端配对引物的速度延伸，当错配碱基的数目达到一定程度或者条件达到一定的严谨程度时，3'末端碱基则因磷酸二酯键的形成困难而不能继续延伸，反应终止，不能得到特异长度的扩增条带(YeS,etal.,NucleicAcidsRes,2001,29,e88)。因此，有必要建立一种新的基于PCR技术的基因分型法来鉴定水稻产生ALS抑制剂类除草剂抗性新的基因变异，为ALS抑制剂类除草剂抗性品种资源的鉴定和品种高效选育提供技术支撑。三、
技术实现思路
技术问题：本专利技术针对传统本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定水稻产生ALS基因突变的四引物分子标记方法，其特征在于，所述ALS基因突变指的是ALS抑制剂类除草剂抗性基因在编码区第1642和1643位点发生TG到AT的变异，用ALS基因特异性引物：正向外引物ALS‑O‑F序列为5’‑AGGTGAGGCAATCATCGCTAC‑3’反向外引物ALS‑O‑R序列为5’‑ATGGGTCATTCAGGTCAAACA‑3’正向内引物ALS‑I‑F序列为5’‑AACCAACATTTGGGTATGGT TGTGCTAA‑3’反向内引物ALS‑I‑R序列5’‑CTATTTGCCTTGTAAAACCTATCCTTCC‑3’扩增水稻基因组DNA，如果同时有646bp和321bp两条特征条带，则为不含ALS基因突变的纯合体，不具有ALS抑制剂类除草剂抗性；如果同时有646bp和381bp两条特征条带，则为含ALS基因突变的纯合体，具有ALS抑制剂类除草剂抗性；如果同时存在646bp、381bp和321bp三条特征条带，则为含ALS基因突变的杂合体，同样具有ALS抑制剂类除草剂抗性。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定水稻产生ALS基因突变的四引物分子标记方法，其特征在于，所述ALS基因突变指的是ALS抑制剂类除草剂抗性基因在编码区第1642和1643位点发生TG到AT的变异，用ALS基因特异性引物：正向外引物ALS-O-F序列为5’-AGGTGAGGCAATCATCGCTAC-3’反向外引物ALS-O-R序列为5’-ATGGGTCATTCAGGTCAAACA-3’正向内引物ALS-I-F序列为5’-AACCAACATTTGGGTATGGTTGTGCTAA-3’反向内引物ALS-I-R序列5’-CTATTTGCCTTGTAAAACCTATCCTTCC-3’扩增水稻基因组DNA，如果同时有646bp和321bp两条特征条带，则为不含ALS基因突变的纯合体，不具有ALS抑制剂类除草剂抗性；如果同时有646bp和381bp两条特征条带，则为含ALS基因突变的纯合体，具有ALS抑制剂类除草剂抗性；如果同时存在646bp、381bp和321bp三条特征条带，则为含ALS基因突变的杂合体，同样具有ALS抑制剂类除草剂抗性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：(1)水稻植株基因组DNA的提取；(2)将权利要求1所述的四条分子标记引物ALS-O-F、ALS-O-R、ALS-I-F和ALS-I-R加入同一PCR反应体系，并对水稻种质资源或育...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈涛，张亚东，赵凌，张善磊，朱镇，赵庆勇，姚姝，周丽慧，赵春芳，王才林，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32