用于检测胰腺癌的基因标志物、试剂盒及胰腺癌检测方法技术

本发明专利技术涉及用于检测胰腺癌的基因标志物、试剂盒及胰腺癌检测方法。基因标志物包括一个或两个以上以下基因：麦芽糖酶、C型外源凝集素家族4成员C、分选蛋白7、间质同源框2、FAT非典型钙粘蛋白1、黄素包含单氧酶3、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白、磷脂磷酸酶相关蛋白3、α白蛋白和胶原蛋白V型α2链；通过高通量测序检测胰腺癌基因标志物中5‑羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定胰腺癌是否存在。本发明专利技术检测胰腺癌具有安全无创、DNA来源广泛、准确性高、操作方便、用户体验好优点。本发明专利技术可与其他临床指标相结合，为胰腺癌筛查、诊断、治疗与预后提供更准确的判断。

Gene markers, kits and pancreatic cancer detection methods for detecting pancreatic cancer

The invention relates to a gene marker, a kit and a method for detecting pancreatic cancer for detecting pancreatic cancer. Genetic markers including one or more than two following genes: maltase, C type lectin family 4 member C, sorting protein 7, interstitial homeobox 2, FAT 1, including the atypical cadherin flavin monooxygenase 3, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and phospholipid phosphatase associated protein 3 and alpha albumin and collagen type V alpha 2 chain; the content of high-throughput sequencing to detect pancreatic cancer genetic markers in 5 hydroxymethylcytosine, to determine the existence of pancreatic cancer. The invention has the advantages of safety, non-invasive, wide DNA source, high accuracy, convenient operation and good user experience. The present invention can be combined with other clinical indicators to provide more accurate judgment for screening, diagnosis, treatment and prognosis of pancreatic cancer.

【技术实现步骤摘要】
用于检测胰腺癌的基因标志物、试剂盒及胰腺癌检测方法
本专利技术涉及胰腺癌的临床分子诊断的领域。具体地，本专利技术涉及用于检测胰腺癌的基因标志物、试剂盒及胰腺癌检测方法。
技术介绍
胰腺癌（PCA）是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%为起源于腺管上皮的导管腺癌。本病发病率男性高于女性，男女之比为1.5～2:1，男性患者远较绝经前的妇女多见，绝经后妇女的发病率与男性相仿。目前胰腺癌的病因尚不十分清楚。其发生与吸烟、饮酒、高脂肪和高蛋白饮食、过量饮用咖啡、环境污染及遗传因素有关；近年来的调查报告发现糖尿病人群中胰腺癌的发病率明显高于普通人群；也有人注意到慢性胰腺炎病人与胰腺癌的发病存在一定关系，发现慢性胰腺炎病人发生胰腺癌的比例明显增。近年来，胰腺癌的发病率明显升高，30年代以来，美、英、日等国PCA发病率增加了2~4倍。上海市PCA在恶性肿瘤中的发病率由1974年的第14位上升到1993年的第8位。PCA发病率增加的速度仅次于胰腺癌，每10年约增加1.5%。虽然，近年来腹部外科的发展日新月异。很多腹部疾患，包括肿瘤在内，其诊断、治疗的水平随着基础医学的进展，影像学技术的提高和分子诊断技术的应用而得到极大提高。但是胰腺癌的诊断和治疗方面的进展却不尽人意。PCA起病隐匿，症状缺乏特异性，常伴有早期扩散与转移现象，是预后最差的恶性肿瘤之一。85%的胰腺癌病人就诊时已属晚期，仅20%左右可行手术治疗。每年PCA死亡与发病比率为0.99，确诊病人的五年生存率为1.3%，平均中位生存期仅4.1个月，被称为“二十一世纪医学的顽固堡垒”。目前胰腺癌的检测主要通过影像学、组织活检、血清学检测等。然而，影像学易受操作者经验影响，并且依赖于设备，费用昂贵，尤其是在医疗资源有限的情况下，其准确率难以保证，难以广泛和常规应用，并且CT及超声波难以诊断小于2cm的胰腺肿瘤。组织活检是目前临床上确诊胰腺癌的金标准，但组织活检存在很大局限性，例如手术取样的困难，或者某些癌症部位不便进行穿刺，并且穿刺本身也会带来一定的临床风险，反复穿刺筛查更会给患者带来巨大痛苦。血清学检测目前应用最广的是对癌胚抗原（CEA）的检测，但CEA对早期胰腺癌的灵敏度和特异性都不高，往往在肿瘤发生转移后才升高。因此，寻找新的胰腺癌标志物，尤其是预警监测和早期诊断的标志物对提高早期胰腺癌的诊断率，实现早期干预治疗，降低胰腺癌病死率具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术通过对正常样品和胰腺癌样品进行高通量测序，并对其中各基因上的5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）含量进行分析，出乎意料地发现了多个极具信息的可用于检测胰腺癌的基因标志物。因此，本专利技术的第一个方面涉及用于检测胰腺癌的基因标志物，包括一个或两个以上以下基因：麦芽糖酶（SI）、C型外源凝集素家族4成员C（CLEC4C）、分选蛋白7（SNX7）、间质同源框2（MEOX2）、FAT非典型钙粘蛋白1（FAT1）、黄素包含单氧酶3（FMO3）、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR）、磷脂磷酸酶相关蛋白3（PLPPR3）、α白蛋白（AFM）和胶原蛋白V型α2链（COL5A2）。优选的，所述基因标志物包括SI、CLEC4C、SNX7、MEOX2、FAT1、FMO3、CFTR、PLPPR3、AFM和COL5A2。本专利技术还涉及上述基因标志物在检测胰腺癌中的用途，通过高通量测序检测胰腺癌基因标志物中5-羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定胰腺癌是否存在。本专利技术的第二个方面涉及用于检测胰腺癌的方法，包括以下步骤：a）测定正常样品和受试者样品中本专利技术所述的基因标志物的5-hmC的含量；b）用正常样品中所述基因标志物的5-hmC含量作为参照，将受试者样品中对应的基因标志物的5-hmC含量标准化；c）对经标准化的所述基因标志物的5-hmC含量进行数学关联，并获得评分；d）根据所述评分获得检测结果。在一个实施方案中，所述样品是受试者或正常人体液中游离的DNA片段，或来源于细胞器、细胞以及组织中的完整基因组DNA。其中，体液是血液、尿液、汗液、痰液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁、胰腺液等。在一个实施方案中，本专利技术所述的基因标志物的5-hmC含量可通过本领域技术人员已知的任何方法进行测定，例如包括但不限于，葡糖基化法、限制性内切酶法、化学标记法、与高通量测序方法联用的沉淀法、单分子实时测序法（SMRT）、氧化重亚硫酸盐测序法（OxBS-Seq）等。葡糖基化法的原理是采用T4噬菌体β-葡萄糖转移酶(β-GT),在葡萄糖供体底物尿核苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glu)存在下,将葡萄糖转移至羟基位置,从而生成β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶(5-ghmC)。同时可采用同位素标记底物进行定量。在葡糖基化法基础上进一步发展出限制性内切酶法和化学标记法。限制性内切酶法的原理是：葡糖基化反应改变了一些限制性内切酶的酶切特性。甲基化依赖的限制性内切酶MspI和HpaII可识别同样的序列(CCGG),但它们对甲基化状态的敏感性是不同:MspI识别并切割5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-hmC,但不能切割5-ghmC;HpaII只切割完全未修饰的位点,胞嘧啶上的任何修饰(5-mC、5-hmC、5-ghmC)均阻碍切割。若CpG位点含有5-hmC,那么糖基化、酶解之后能检测到条带,未糖基化对照反应中没有条带;同时可采用qPCR进行定量分析。另外,其他限制性内切酶也同样存在阻碍5-ghmC酶切的情况,可应用于5-hmC检测(如:GmrSD,MspJI,PvuRts1I,TaqI等)。化学标记法的原理是：将酶反应底物上的葡萄糖进行化学修饰转变成UDP-6-N3-glucose,将6-N3-glucose转移到羟甲基位置,生成N3-5ghmC。随后,通过点击化学方法在每个5-hmC上添加一分子生物素,结合下一代高通量DNA测序技术或单分子测序技术,可分析5-hmC在基因组DNA中的分布情况。沉淀法是将5-hmC用特殊方式修饰后再将其特异性地从基因组DNA中捕获下来，并进行测序分析。氧化重亚硫酸盐测序法是首个以单碱基分辨率对5-hmC进行定量测序的方法.首先将5-hmC进行KRuO4氧化处理,生成5-甲酰胞嘧啶（5fC）,然后采用重亚硫酸盐测序。在此过程中,5-hmC先氧化为5fC,而后脱氨形成U。通常，同时采用多种检测方法对5-hmC进行定量检测。在本专利技术的一个实施方案中，利用化学标记法结合高通量测序来测定本专利技术的基因标志物的5-hmC含量。在该具体的实施方案中，测定本专利技术的基因标志物的5-hmC含量的方法包括以下步骤：将来自胰腺癌患者和正常人的样品的DNA片段化；将所述片段化的DNA末端修复并末端补齐；将末端补齐的DNA与测序接头连接，获得连接产物；通过标记反应对连接产物中的5-羟甲基胞嘧啶进行标记；富集含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段，获得富集产物；对富集产物进行PCR扩增，获得测序文库；对测序文库进行高通量测序，获得测序结果；根据测序结果确定5-羟甲基胞嘧啶在基因上的含量。其中，标记反应包括：i）利用糖基转移酶将带有修饰基团的糖共价连接到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上，和ii)将直接或间接连有生物素的点击化学底物与带有修饰基团的5-羟甲基胞嘧啶反本文档来自技高网...

【技术保护点】
基因标志物用于检测胰腺癌的用途，通过高通量测序检测胰腺癌基因标志物中5‑羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定胰腺癌是否存在，所述基因标志物包括一个或两个以上以下基因：麦芽糖酶（SI）、C型外源凝集素家族4成员C（CLEC4C）、分选蛋白7（SNX7）、间质同源框2（MEOX2）、FAT非典型钙粘蛋白1（FAT1）、黄素包含单氧酶3（FMO3）、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR）、磷脂磷酸酶相关蛋白3（PLPPR3）、α白蛋白（AFM）和胶原蛋白V型α2链（COL5A2）。

【技术特征摘要】
1.基因标志物用于检测胰腺癌的用途，通过高通量测序检测胰腺癌基因标志物中5-羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定胰腺癌是否存在，所述基因标志物包括一个或两个以上以下基因：麦芽糖酶（SI）、C型外源凝集素家族4成员C（CLEC4C）、分选蛋白7（SNX7）、间质同源框2（MEOX2）、FAT非典型钙粘蛋白1（FAT1）、黄素包含单氧酶3（FMO3）、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白（CFTR）、磷脂磷酸酶相关蛋白3（PLPPR3）、α白蛋白（AFM）和胶原蛋白V型α2链（COL5A2）。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述基因标志物包括SI、CLEC4C、SNX7、MEOX2、FAT1、FMO3、CFTR、PLPPR3、AFM和COL5A2。3.一种用于检测胰腺癌的方法，其特征在于包括以下步骤：a）测定正常样品和受试者样品中权利要求1和2所述的基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶的含量；b）用正常样品中所述基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量作为参照，将受试者样品中对应的基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量标准化，正常样品和受试者样品中同一基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量分别为X和Y，则受试者样品中该基因标志物的标准化5-羟甲基胞嘧啶含量为Y/X；c）对步骤b）中经标准化的所述基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量进行数学关联，并获得评分P；d）根据所述评分P的数值大小得到受试者样品是否患有胰腺癌的检测结果。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤a）包括如下步骤：将来自胰腺癌患者和正常人的样品的DNA片段化；将所述片段化的DNA末端修复并末端补齐；将末端补齐的DNA与测序接头连接，获得连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆星宇，宋艳群，彭莱，张子谋，
申请(专利权)人：上海易毕恩生物技术有限公司，上海易毕恩基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31