用于检测肝肿瘤良恶性的基因标志物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及用于检测肝肿瘤良恶性的基因标志物、试剂盒及检测方法。基因标志物包括一个或两个以上以下基因：FAT非典型钙粘蛋白1、雌激素相关受体γ、性别决定基因y染色体区域盒家族成员9、纤毛状络合物子单元1、1号染色体开放阅读框125抗体、络丝蛋白、转铁蛋白、TNF受体超家族成员、胰腺和十二指肠同圆框1、α‑酸性糖蛋白2；通过高通量测序检测肝肿瘤基因标志物中5‑羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定肝肿瘤良恶性。本发明专利技术检测肝肿瘤良恶性具有安全无创、DNA来源广泛、准确性高、操作方便、用户体验好优点。本发明专利技术可与其他临床指标相结合，为肝肿瘤后续筛查、诊断、治疗与预后提供更准确的判断。

Gene markers, kits and detection methods for detecting benign and malignant liver tumors

The present invention relates to gene markers, kits and detection methods for detecting benign and malignant liver tumors. Genetic markers including one or more than two genes: FAT following the atypical cadherin 1, estrogen related receptor gamma, sex determining gene chromosome Y box family member 9, ciliated complex sub unit of chromosomes 1, 1 open reading frame 125 antibody, reelin, transferrin, TNF receptor superfamily, the duodenum and pancreas with box 1, alpha acid glycoprotein 2; the content of high-throughput sequencing to detect liver cancer genetic markers in 5 hydroxymethylcytosine, to determine Liver Benign and malignant tumors. The invention has the advantages of safety, non-invasive, wide DNA source, high accuracy, convenient operation and good user experience for detecting benign and malignant hepatic tumors. The present invention can be combined with other clinical indicators to provide more accurate judgment for subsequent screening, diagnosis, treatment and prognosis of liver tumors.

【技术实现步骤摘要】
用于检测肝肿瘤良恶性的基因标志物、试剂盒及检测方法
本专利技术涉及肝肿瘤良恶性的临床分子诊断
具体的，本专利技术涉及用于检测肝肿瘤良恶性的基因标志物、试剂盒及肝肿瘤良恶性的检测方法。
技术介绍
肿瘤分良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。良性肿瘤生长缓慢，除在要害部位占位有影响外，一般对健康和生命没有危害。恶性肿瘤生长迅速，与人体争夺营养，产生有害代谢产物，破坏人体正常器官组织结构，对人体健康极为有害，如不及时进行有效治疗将会夺人生命。常见的肝良性肿瘤有肝细胞腺瘤、肝管细胞腺瘤、肾上腺残余瘤、血管瘤、错构瘤等。肝恶性肿瘤就是指肝细胞肝癌，即我们通常讲的肝癌。肝癌是最常见的全球恶性肿瘤之一。据世界卫生组织2008年统计，全球每年新发病748300例，死亡695900例，其中50%以上发生在中国。良性肿瘤与恶性肿瘤二者在细胞形态、组织结构、生长方式、增长速度和对人体影响等方面均有本质的不同，所以治疗方式上也不一样。把恶性肿瘤当作良性肿瘤治疗就会贻误病人。反之，若把良性肿瘤当作恶性肿瘤治疗，不仅造成病人精神上负担，而且由于采取许多不必要的治疗手段，致使病人遭受痛苦和损失。但某些良性肿瘤和恶性肿瘤有着相近似的生长形式，给诊断造成很大的困难。如有的良性肿瘤生长较快，状似恶性肿瘤；而有的恶性肿瘤有可能生长缓慢很象良性肿瘤。甚至有的肿瘤本身就具有良性恶性的两种特点，虽然肿瘤细胞表现为良性，而且有完整包膜，但它是多中心性生长，治疗后较一般良性肿瘤复发率高，就其临床的某些特点来看很似恶性肿瘤，固称之为临界性肿瘤。此外，某些良性肿瘤在其发展过程中有变为恶性的可能，也要引起临床的重视。因此，针对肝良性肿瘤和恶性肿瘤寻找诊断标志物，提高对肝良性肿瘤与恶性肿瘤区分鉴别能力，对临床诊断具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术通过对良性肝肿瘤样品与肝癌样品进行高通量测序，并对其中各基因上的5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）含量进行分析，出乎意料地发现了多个极具信息的可用于检测肝肿瘤良恶性的基因标志物。因此，本专利技术的第一个方面涉及用于检测肝肿瘤良恶性的基因标志物，包括一个或两个以上以下基因：FAT非典型钙粘蛋白1(FAT1)、雌激素相关受体γ（ESRRG）、性别决定基因y染色体区域盒家族成员9（SOX9）、纤毛状络合物子单元1（EVC）、1号染色体开放阅读框125抗体（AXDND1）、络丝蛋白（RELN）、转铁蛋白（TF）、TNF受体超家族成员（TNFRSF11B）、胰腺和十二指肠同圆框1（PDX1）、α-酸性糖蛋白2（ORM2）。优选的，所述基因标志物包括FAT1、ESRRG、SOX9、EVC、AXDND1、RELN、TF、TNFRSF11B、PDX1和ORM2。本专利技术还涉及上述基因标志物在检测肝肿瘤良恶性中的用途，通过高通量测序检测肺癌基因标志物中5-羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定肝肿瘤的良性。本专利技术的第二个方面涉及用于检测肝肿瘤良恶性的方法，包括以下步骤：a）测定良性肝肿瘤样品和肝癌受试者样品中本专利技术所述的基因标志物的5-hmC的含量；b）用良性肝肿瘤样品中所述基因标志物的5-hmC含量作为参照，将肝癌受试者样品中对应的基因标志物的5-hmC含量标准化；c）对经标准化的所述基因标志物的5-hmC含量进行数学关联，并获得评分；d）根据所述评分获得区分结果。在一个实施方案中，所述样品是受试者体液中游离的DNA片段，或来源于细胞器、细胞以及组织中的完整基因组DNA。其中，体液是血液、尿液、汗液、痰液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁、胰腺液等。在一个实施方案中，本专利技术所述的基因标志物的5-hmC含量可通过本领域技术人员已知的任何方法进行测定，例如包括但不限于，葡糖基化法、限制性内切酶法、化学标记法、与高通量测序方法联用的沉淀法、单分子实时测序法（SMRT）、氧化重亚硫酸盐测序法（OxBS-Seq）等。葡糖基化法的原理是采用T4噬菌体β-葡萄糖转移酶(β-GT),在葡萄糖供体底物尿核苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glu)存在下,将葡萄糖转移至羟基位置,从而生成β-葡萄糖基-5-羟甲基胞嘧啶(5-ghmC)。同时可采用同位素标记底物进行定量。在葡糖基化法基础上进一步发展出限制性内切酶法和化学标记法。限制性内切酶法的原理是：葡糖基化反应改变了一些限制性内切酶的酶切特性。甲基化依赖的限制性内切酶MspI和HpaII可识别同样的序列(CCGG),但它们对甲基化状态的敏感性是不同:MspI识别并切割5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-hmC,但不能切割5-ghmC;HpaII只切割完全未修饰的位点,胞嘧啶上的任何修饰(5-mC、5-hmC、5-ghmC)均阻碍切割。若CpG位点含有5-hmC,那么糖基化、酶解之后能检测到条带,未糖基化对照反应中没有条带;同时可采用qPCR进行定量分析。另外,其他限制性内切酶也同样存在阻碍5-ghmC酶切的情况,可应用于5-hmC检测(如:GmrSD,MspJI,PvuRts1I,TaqI等)。化学标记法的原理是：将酶反应底物上的葡萄糖进行化学修饰转变成UDP-6-N3-glucose,将6-N3-glucose转移到羟甲基位置,生成N3-5ghmC。随后,通过点击化学方法在每个5-hmC上添加一分子生物素,结合下一代高通量DNA测序技术或单分子测序技术,可分析5-hmC在基因组DNA中的分布情况。沉淀法是将5-hmC用特殊方式修饰后再将其特异性地从基因组DNA中捕获下来，并进行测序分析。氧化重亚硫酸盐测序法是首个以单碱基分辨率对5-hmC进行定量测序的方法.首先将5-hmC进行KRuO4氧化处理,生成5-甲酰胞嘧啶（5fC）,然后采用重亚硫酸盐测序。在此过程中,5-hmC先氧化为5fC,而后脱氨形成U。通常，同时采用多种检测方法对5-hmC进行定量检测。在本专利技术的一个实施方案中，利用化学标记法结合高通量测序来测定本专利技术的基因标志物的5-hmC含量。在该具体的实施方案中，测定本专利技术的基因标志物的5-hmC含量的方法包括以下步骤：将来自肝癌患者和良性肝肿瘤患者的DNA片段化；将所述片段化的DNA末端修复并末端补齐；将末端补齐的DNA与测序接头连接，获得连接产物；通过标记反应对连接产物中的5-羟甲基胞嘧啶进行标记；富集含有5-羟甲基胞嘧啶标记的DNA片段，获得富集产物；对富集产物进行PCR扩增，获得测序文库；对测序文库进行高通量测序，获得测序结果；根据测序结果确定5-羟甲基胞嘧啶在基因上的含量。其中，标记反应包括：i）利用糖基转移酶将带有修饰基团的糖共价连接到5-羟甲基胞嘧啶的羟甲基上，和ii)将直接或间接连有生物素的点击化学底物与带有修饰基团的5-羟甲基胞嘧啶反应。其中，步骤i）和步骤ii）可以按顺序进行，也可以在一个反应中同时进行。这种标记方法减少了测序所需的样本量，且5-羟甲基胞嘧啶上的生物素标签使其在测序中显示出更高的动力学信号，提高了核苷酸识别的准确性。在该实施方案中，所述糖基转移酶包括但不限于：T4噬菌体β-葡糖基转移酶（β-GT)、T4噬菌体α-葡糖基转移酶（α-GT）及其具有相同或相似活性的衍生物、类似物、或重组酶；所述带有修饰基团的糖包括但不限于：带有叠氮修饰的糖类（例如6-N3-葡萄糖）或带有其他化学修饰（例如羰基本文档来自技高网...

【技术保护点】
基因标志物用于检测肝肿瘤良恶性的用途，通过高通量测序检测肝肿瘤基因标志物中5‑羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定肝肿瘤良恶性，包括一个或两个以上以下基因：FAT非典型钙粘蛋白1 (FAT1)、雌激素相关受体γ（ESRRG）、性别决定基因y染色体区域盒家族成员9（SOX9）、纤毛状络合物子单元1（EVC）、1号染色体开放阅读框125抗体（AXDND1）、络丝蛋白（RELN）、转铁蛋白（TF）、TNF受体超家族成员（TNFRSF11B）、胰腺和十二指肠同圆框1（PDX1）、α‑酸性糖蛋白2（ORM2）。

【技术特征摘要】
1.基因标志物用于检测肝肿瘤良恶性的用途，通过高通量测序检测肝肿瘤基因标志物中5-羟甲基胞嘧啶的含量，从而判定肝肿瘤良恶性，包括一个或两个以上以下基因：FAT非典型钙粘蛋白1(FAT1)、雌激素相关受体γ（ESRRG）、性别决定基因y染色体区域盒家族成员9（SOX9）、纤毛状络合物子单元1（EVC）、1号染色体开放阅读框125抗体（AXDND1）、络丝蛋白（RELN）、转铁蛋白（TF）、TNF受体超家族成员（TNFRSF11B）、胰腺和十二指肠同圆框1（PDX1）、α-酸性糖蛋白2（ORM2）。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述基因标志物包括包括FAT1、ESRRG、SOX9、EVC、AXDND1、RELN、TF、TNFRSF11B、PDX1和ORM2。3.一种用于检测肝肿瘤良恶性的方法，包括以下步骤：a）测定良性肝肿瘤样品和肝癌受试者样品中权利要求1和2所述的基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶的含量；b）用良性肝肿瘤样品中所述基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量作为参照，将肝癌受试者样品中对应的基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量标准化，良性肝肿瘤样品和肝癌受试者样品中同一基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量分别为X和Y，则肝癌受试者样品中该基因标志物的标准化5-羟甲基胞嘧啶含量为Y/X；c）对步骤b）中经标准化的所述基因标志物的5-羟甲基胞嘧啶含量进行数学关联，并获得评分P；d）根据所述评分P大小得到肝肿瘤良恶性的检测结果。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤a）包括如下步骤：将来自肝癌患者和良性肝肿瘤患者的DNA片段化；将所述片段化的DNA末端修复并末端补齐；将末端补齐的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆星宇，宋艳群，彭莱，张子谋，
申请(专利权)人：上海易毕恩生物技术有限公司，上海易毕恩基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31