一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒和方法。该试剂盒包括预处理液、裂解液、DNA沉淀液、结合液、磁珠悬浮液、漂洗液和洗脱液。本发明专利技术的方法是先将甘蔗糖制品和预处理液混匀，处理后离心，收集沉淀；沉淀经裂解、去蛋白和DNA沉淀获得初步提取的DNA，用水溶解DNA；加入结合液和磁珠悬浮液，分离磁珠，磁珠再经过两次漂洗和洗脱获得纯化的DNA。本发明专利技术提供的试剂盒和方法提取获得的甘蔗糖制品DNA含量和纯度较高、且提取过程中不使用酚、氯仿等有毒试剂，对环境和实验人员不会造成危害。

An efficient kit and method for extraction of DNA from sugarcane sugar products

The invention discloses a reagent box and a method for efficiently extracting sugarcane sugar product DNA. The kit includes pretreatment solution, lysis solution, DNA precipitation solution, binding solution, magnetic bead suspension, rinse solution and eluent. The method of the invention is to cane sugar products and pretreatment liquid mixing, after centrifugation, collecting precipitation; precipitation by cracking, to obtain preliminary extraction and precipitation of DNA protein DNA, DNA dissolved in water; adding combined with liquid and magnetic suspension, magnetic separation, magnetic beads after two times washing and elution for purification DNA. The kit and method provided by the invention can be used for extracting sugar cane products with high content and purity of DNA, and no toxic reagents such as phenol and chloroform are extracted in the process of extraction, which will not cause harm to the environment and laboratory personnel.

【技术实现步骤摘要】
一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒和方法
本专利技术属于分子生物学
，特别涉及一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒和方法。
技术介绍
甘蔗是世界上重要的糖能兼用作物，主要种植与热带与亚热带地区，以甘蔗加工而得的甘蔗糖制品(白糖，红糖，原糖等)的贸易涉及全球范围。近年来，利用转基因技术进行甘蔗的遗传改良在世界各国得到广泛应用，获得一大批转基因植株。近期有消息称，巴西国际生物安全技术委员会已经批准全球首款转基因甘蔗进入市场。为了保证食品的安全，甘蔗糖制品的转基因检测开始受到重视。转基因检测的大多数是以PCR为基础的检测方法，因此提取高质量的DNA是开展转基因检测的基础。目前常用的植物基因组DNA提取纯化的方法有SDS法、CTAB法和利用介质吸附DNA的方法(柱式法和磁珠法)。甘蔗糖制品是通过蔗茎压榨获取蔗汁，然后澄清、煮糖等程序加工而来。由于甘蔗汁中的主要成分是水，DNA含量低，另外加工过程中需要添加石灰、澄清剂等并经过高温煮糖，这些过程都会造成植物细胞破裂，DNA断裂、降解，使得糖制品中的DNA含量极少，片段较短。另外，在糖加工过程还会产生多糖、焦糖色素、多酚等杂质，这些在DNA提取过程中很难去除，利用传统的DNA提取方法和现有的DNA提取试剂盒，获得的DNA产量和纯度都较低，无法满足下一步试验的要求。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供一种高效提取甘蔗糖制品DNA的方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，包括：预处理液、裂解液、DNA沉淀液、结合液、磁珠悬浮液；其中，预处理液为10％～20％(w/v)的PEG8000、25％～50％(v/v)异丙醇、或10％(w/v)的PEG8000加25％(v/v)异丙醇形成的混合液；裂解液的组成如下：300～800mMNaCl、30～80mMTris-HCl、30～80mMEDTA、2～4％(w/v)SDS，2～3％(w/v)PVPP或PVP，pH8.0，溶剂为水；DNA沉淀液为10％～30％(w/v)的PEG8000；结合液的组成如下：10％～15％(w/v)的PEG8000、2～6MGITC、30～60mMNaCl、30～60mMTris-HCl，pH6.4，溶剂为水。所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，还包括漂洗液和洗脱液。所述的漂洗液用于洗去不与磁珠结合的蛋白，其组成优选如下：50％(v/v)乙醇、0.2MNaCl、10mMEDTA、50mMTris-HCl、2MGITC，pH7.6，溶剂为水。所述的洗脱液用于将与磁珠结合的DNA洗脱下来，其组成优选如下：10mMTris-HCl、1mMEDTA、pH8.0，溶剂为水。所述的甘蔗糖制品是指由甘蔗汁直接加工生产得到的红糖、黑糖、原糖、白糖等糖制品。所述的预处理液优选为10％(w/v)的PEG8000。所述的裂解液的组成优选如下：500mMNaCl、50mMTris-HCl、50mMEDTA、4％(w/v)SDS，2％(w/v)PVPP或PVP，pH8.0，溶剂为水。所述的DNA沉淀液优选为20％(w/v)的PEG8000。所述的结合液的组成优选如下：10％(w/v)的PEG8000、4MGITC、50mMNaCl、50mMTris-HCl，pH6.4，溶剂为水。所述的磁珠悬浮液的浓度为10mg/mL。所述的磁珠优选为羟基磁珠。一种高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，是使用上述试剂盒中的试剂进行，包括如下步骤：(1)预处理：将3～5g甘蔗糖制品和10～20mL预处理液混匀，于-20～-80℃处理至少24h，第一次离心，收集沉淀；(2)DNA的初步提取：在沉淀中加入500～1000μL裂解液，混匀后于65～75℃，温浴15～30min；接着加入80～100μL浓度为10M的NH4AC或浓度为3M的KAC，冰上放置，第二次离心，取上清；接着在上清中加入等体积的DNA沉淀液进行沉淀，第三次离心，取沉淀；用浓度为70～75％(v/v)的乙醇清洗沉淀，加入100～200μL水溶解DNA；(3)DNA的纯化：①在步骤(2)最终得到的溶液中加入200～400μL结合液和20～40μL浓度为10mg/mL的磁珠悬浮液，漩涡震荡，置于磁力架上静置，分离磁珠；②在磁珠中加入漂洗液，漩涡混匀，置于磁力架上静置，分离磁珠；③在磁珠中加入浓度为75％(v/v)的乙醇，漩涡混匀，置于磁力架上静置，分离磁珠；④待磁珠干燥，乙醇挥发完全，加入洗脱液，60～65℃温浴10～15min，分离磁珠，上清为纯化得到的DNA。步骤(1)中所述的处理的时间优选为48h。适当延长处理的时间可以提高DNA的得率，但是同时也会适当更多的杂质沉淀，处理48h效果最佳。步骤(1)中所述的第一次离心的条件优选为10000rpm离心30min。步骤(2)中所述的冰上放置的时间优选为10min。步骤(2)中所述的第二次离心的条件优选为4℃下12000rpm离心10min。步骤(2)中所述的进行沉淀的时间优选为10min。步骤(2)中所述的第三次离心的条件优选为12000rpm离心10min。步骤(2)中所述的清洗沉淀的次数优选为1次。步骤(3)①中所述的漩涡震荡的时间优选为5min。步骤(3)①中所述的置于磁力架上静置的时间优选为30s。步骤(3)②中所述的漂洗液的用量优选为400～800μL；更优选为500μL。步骤(3)②中所述的漩涡混匀的时间优选为1min。步骤(3)②中所述的置于磁力架上静置的时间优选为30s。步骤(3)③中所述的乙醇的用量优选为500～1000μL；更优选为500～800μL。步骤(3)③中所述的漩涡混匀的时间优选为5min。步骤(3)③中所述的置于磁力架上静置的时间优选为30s。步骤(3)③优选为重复一次。步骤(3)④中所述的洗脱液的用量优选为30～50μL；更优选为30μL。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)本专利技术提供的试剂盒提取获得的甘蔗糖制品DNA含量和纯度较高。(2)本专利技术提供的试剂盒和方法克服现有技术由于甘蔗糖制品中多糖、多酚、色素等杂质难以去除而影响后续试验的问题，提高提取DNA的纯度和DNA的产率，并且提取过程中不使用酚、氯仿等有毒试剂，对环境和实验人员不会造成危害。附图说明图1是实施例2三种方法提取到的DNA的检测图；泳道1为方法1提取的DNA；泳道2为方法2提取的DNA；泳道3为方法3提取的DNA；泳道M为DNAMarker。图2是实施例3三种方法提取到的DNA为模板扩增ScALS基因的结果图；其中，泳道1～3为本专利技术方法提取的DNA；泳道4～6为植物基因组提取试剂盒(柱式法)提取的DNA；泳道7～9为植物基因组提取试剂盒(磁珠法)提取的DNA；泳道10为阳性对照；泳道11为阴性对照。图3是实施例3三种方法提取到的DNA为模板扩增ScF2KP基因的结果图；其中，泳道1～3为本专利技术方法提取的DNA；泳道4～6为植物基因组提取试剂盒(柱式法)提取的DNA；泳道7～9为植物基因组提取试剂盒(磁珠法)提取的DNA；泳道10为阳性对照；泳道11为阴性对照。图4是本专利技术的试剂盒及方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，其特征在于包括：预处理液、裂解液、DNA沉淀液、结合液、磁珠悬浮液；其中，预处理液为10％～20％(w/v)的PEG8000、25％～50％(v/v)异丙醇、或10％(w/v)的PEG8000加25％(v/v)体积异丙醇形成的混合液；裂解液的组成如下：300～800mM NaCl、30～80mM Tris‑HCl、30～80mMEDTA、2～4％(w/v)SDS，2～3％(w/v)PVPP或PVP，pH 8.0，溶剂为水；DNA沉淀液为10％～30％(w/v)的PEG8000；结合液的组成如下：10％～15％(w/v)的PEG8000、2～6M GITC、30～60mM NaCl、30～60mM Tris‑HCl，pH6.4，溶剂为水。

【技术特征摘要】
1.一种高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，其特征在于包括：预处理液、裂解液、DNA沉淀液、结合液、磁珠悬浮液；其中，预处理液为10％～20％(w/v)的PEG8000、25％～50％(v/v)异丙醇、或10％(w/v)的PEG8000加25％(v/v)体积异丙醇形成的混合液；裂解液的组成如下：300～800mMNaCl、30～80mMTris-HCl、30～80mMEDTA、2～4％(w/v)SDS，2～3％(w/v)PVPP或PVP，pH8.0，溶剂为水；DNA沉淀液为10％～30％(w/v)的PEG8000；结合液的组成如下：10％～15％(w/v)的PEG8000、2～6MGITC、30～60mMNaCl、30～60mMTris-HCl，pH6.4，溶剂为水。2.根据权利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，其特征在于：还包括漂洗液和洗脱液。3.根据权利要求2所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，其特征在于：所述的漂洗液的组成如下：50％(v/v)乙醇、0.2MNaCl、10mMEDTA、50mMTris-HCl、2MGITC，pH7.6，溶剂为水；所述的洗脱液的组成如下：10mMTris-HCl、1mMEDTA、pH8.0，溶剂为水。4.根据权利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，其特征在于：所述的预处理液为10％(w/v)的PEG8000；所述的裂解液的组成如下：500mMNaCl、50mMTris-HCl、50mMEDTA、4％(w/v)SDS，2％(w/v)PVPP或PVP，pH8.0，溶剂为水；所述的DNA沉淀液为20％(w/v)的PEG8000；所述的结合液的组成如下：10％(w/v)的PEG8000、4MGITC、50mMNaCl、50mMTris-HCl，pH6.4，溶剂为水。5.根据权利要求1所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，其特征在于：所述的磁珠悬浮液的浓度为10mg/mL。6.根据权利要求5所述的高效提取甘蔗糖制品DNA的试剂盒，其特征在于：所述的磁珠为羟基磁珠。7.一种高效提取甘蔗糖制品DNA的方法，其特征在于：使用权利要求1～6任一项所述的试剂盒进行，包括如下步骤：(1)预处理：...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾巧英，凌秋平，齐永文，刘睿，吴嘉云，胡斐，
申请(专利权)人：广东省生物工程研究所广州甘蔗糖业研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44