一种游离DNA保存液及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种游离DNA保存液，包括以下组分，以100mL计，所述各组分的含量为：咪唑烷基脲8～32g；乙二胺四乙酸二钠0.005～0.036mol；甘氨酸0～2.7g；Triton X‑100 50～100μL；pH稳定剂0～0.005mol；去离子水70～85mL。该游离DNA保存液可以完整地中长期保存人体尿液、组织液中的游离DNA，可以适用多样本尿液、组织液游离DNA的保存及检测，适用范围广，可以保证后续样本检测的准确度和可信度。

Free DNA preservation solution, preparation method and application thereof

The invention discloses a free DNA preservation solution, which comprises the following components, based on 100mL, the content of each component is: imidazolidinyl urea 8 ~ 32g; two sodium EDTA 0.005 ~ 0.036mol; glycine 0 ~ 2.7g; Triton X 100 50 ~ 100 L; pH 0 ~ 0.005mol stabilizer deionized water is 70 ~ 85mL. The free DNA preservation solution can be complete in the long-term preservation of free DNA in human urine, tissue fluid, preservation and detection can be applied to a number of samples of urine and tissue fluid free DNA, wide application range, can ensure the accuracy and reliability of subsequent samples.

【技术实现步骤摘要】
一种游离DNA保存液及其制备方法和应用
本专利技术涉及游离DNA保存领域，具体的涉及一种游离DNA保存液及其制备方法和应用。
技术介绍
细胞凋亡或坏死后，细胞内部的DNA释放入体液形成游离DNA(cfDNA)。而癌症患者的cfDNA中含有的肿瘤循环DNA(ctDNA)与肿瘤的发生发展过程紧密相关。游离DNA与肿瘤组织的基因突变一致，遗传信息丰富；与肿瘤负荷正相关，检测灵敏度高；对疾病的发展最早做出反应；半衰期短(<1.5h)，可实现实时监测。因此，游离DNA作为重要的肿瘤特异性标志物，完整获取和保存则对癌症早筛、阶段用药指导及预后等方面应用提供前提与基础。现有技术中，游离DNA保存常采用血液样本，必需经专业医师操作、过程繁复、且耗费时间；样本成分复杂而保存提取难度较大；游离DNA片段分布范围在35～1500bp，而肿瘤游离DNA片段多集中在100～300bp，片段小易丢失而失去遗传信息的完整性；游离细胞不稳定破碎后释放的细胞内DNA造成游离DNA的污染，导致检测结果失真；样本中DNase丰富使得游离DNA降解快速而难于保存；游离DNA保存通常需要低温条件的冷链运输，成本较高。
技术实现思路
本专利技术旨在解决上面描述的问题。本专利技术的目的是提供一种游离DNA保存液，主要应用于人体尿液、组织液游离DNA的保存。相对于传统的抽血采集的方式来说，尿液样本的采集过程完全无创、操作简便、成本低、易接受，能最大限度的扩大基因疾病筛查或诊断的取样范围。组织液主要指的是腹水及胸水，两者样本通过微创手术即可获得，游离DNA较血浆丰富度更高、含量更多，且可连续收集、动态监测肿瘤随时间的遗传学变异过程，并最终用于临床治疗和诊断。同时本专利技术的保存液，DNA片段保存完整度高，可室温实现中长期保存；可最大程度避免样本稀释，最终降低样本采集、保存、运输成本。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种游离DNA保存液，包括以下组分，以100mL计，所述各组分的含量为：其中，包括以下组分，以100mL计，所述各组分的含量为：其中，包括以下组分，以100mL计，所述各组分的含量为：其中，包括以下组分，以100mL计，所述各组分的含量为：其中，所述游离DNA保存液的pH值范围为5.5～7.0。其中，所述pH稳定剂可以是Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。其中，所述游离DNA保存液与保存样品的比例为1:20～1:10。根据本专利技术的另一方面，提供一种游离DNA保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将预定含量的乙二胺四乙酸二钠、pH稳定剂、咪唑烷基脲、甘氨酸置于烧杯中，60～65℃水浴25～35min；溶解后，添加预定含量的TritonX-100，最后添加去离子水定容至100mL，混合均匀；0.25μm滤膜抽滤，即得游离DNA保存液。其中，包括以下步骤：将预定含量的乙二胺四乙酸二钠、pH稳定剂、咪唑烷基脲、甘氨酸置于烧杯中，65℃水浴30min；溶解后，添加预定含量的TritonX-100，最后添加去离子水定容至100mL，混合均匀；0.25μm滤膜抽滤，即得游离DNA保存液。根据本专利技术的第三个方面，提供游离DNA保存液在保存尿液、组织液游离DNA上的应用。人体尿液、组织液样本中的游离DNA极不稳定，游离细胞破碎后细胞内成分的污染、细菌污染、DNase的催化降解、pH变化均会影响样本中游离DNA的稳定；样本中酮体、蛋白等成分也会对游离DNA造成干扰。本专利技术的游离DNA保存液中的咪唑烷基脲作为甲醛缓释剂可以稳定细胞膜，避免样本细胞内DNA释放到细胞外，污染游离DNA；同时咪唑烷基脲作为广谱抑菌剂可以高效抑制细菌繁殖；是稳定样本游离DNA的主要作用试剂。咪唑烷基脲缓释的甲醛作为交联剂/固定剂，一方面可以稳定样本的细胞、蛋白、DNA，但是如果过量有可能引起DNA质量降低。甘氨酸可以在常温下与咪唑烷基脲缓释出的过剩甲醛结合，生成羟甲基衍生物。研究过程中发现，对于成分简单的尿液、腹水、胸水样本，例如健康人的尿液样本，添加0～2.7g的甘氨酸可以与组分含量为8～32g的咪唑烷基脲缓释的过剩甲醛结合，使得样本中的游离DNA可以很好地保存。然而对于成分复杂的样本，例如孕妇、病患，在实验过程中发现，仅需低浓度甘氨酸辅助稳定pH或不需要添加。DNase作为降解样本游离DNA的重要因素，主要有DNaseI、II、III三种。其中，DNaseI存在于细胞外，最佳pH为7.1，依赖金属离子催化作用；DNaseII存在于溶酶体中，通过内吞作用降解DNA，降解DNA不依赖金属离子，最适pH值为4.5～5.5；DNaseIII定位于细胞核中，其催化DNA降解不依赖金属离子，最适pH值为8.5。在本专利技术的游离DNA保存液中添加0.005～0.036mol的乙二胺四乙酸二钠作为金属离子螯合剂可以络合金属离子从而抑制DNaseI作用。本专利技术的游离DNA保存液中的pH稳定剂的含量在0～0.005mol；可以使保存样本的pH稳定在5.5～7.0，可以抑制DNaseII、DNaseIII降解DNA的活性，同时稳定样本在正常pH范围内，保证样本中各成分的稳定。pH稳定剂可以是Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液等缓冲试剂。同时，甘氨酸也可以作为pH缓冲物质与pH稳定剂共同作用，维持样本pH与各成分的稳定。本专利技术中的乙二胺四乙酸二钠与pH稳定剂的含量均指的是干物质含量。在保存液配制过程中，使用的是乙二胺四乙酸二钠溶液或Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。本专利技术中所包含的去离子水的含量为乙二胺四乙酸二钠溶液和缓冲液的去离子水的含量以及最后定容所加入的去离子水的总和。本专利技术的游离DNA保存液还添加了50～100μL含量范围的TritonX-100，该含量范围的TritonX-100可以破坏DNaseI表面的亲水层，降低DNA酶的活性，从而在室温稳定样本游离DNA。由于保存液中的各组分在样本中尤其在复杂样本中会产生一系列复杂反应，各组分协同作用的结果往往不能预知。所以本专利技术中咪唑烷基脲、乙二胺四乙酸二钠、pH稳定剂、TritonX-100、甘氨酸的比例范围是经过大量试验而获得的；并且针对复杂的样本得到了各组分的优选比例范围。从而使得本专利技术的保存液可以中长期保存样本中的游离DNA，适用样本范围广且保存效果稳定；并且可以保证游离DNA的完整度，避免游离DNA被细胞内DNA污染而干扰检测结果。将预定含量的乙二胺四乙酸二钠、pH稳定剂、咪唑烷基脲、甘氨酸置于烧杯中，60～65℃水浴25～35min；优选的，65℃水浴30min；溶解后，添加预定含量的TritonX-100，最后添加去离子水定容至100mL，混合均匀；0.25μm滤膜抽滤，即得游离DNA保存液。本游离DNA保存液与保存样品的比例为1:20～1:10。在该比例范围内，样本中的游离DNA的具有很好的保存效果。本游离DNA保存液的应用到人体尿液、腹水、胸水游离DNA的保存，可以制成保存试剂盒，包括：存放有该游离DNA保存液的保存管、生物安全袋、说明书、个人信息卡、编号条形码、回寄快递单，组装成游离DNA保存试剂盒；样本保存管为优质无菌、无DNas本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种游离DNA保存液，其特征在于，包括以下组分，以100mL计，所述各组分的含量为：

【技术特征摘要】
1.一种游离DNA保存液，其特征在于，包括以下组分，以100mL计，所述各组分的含量为：2.如权利要求1所述的游离DNA保存液，其特征在于，包括以下组分，以100mL计，所述各组分的含量为：3.如权利要求2所述的游离DNA保存液，其特征在于，包括以下组分，以100mL计，所述各组分的含量为：4.如权利要求2所述的游离DNA保存液，其特征在于，包括以下组分，以100mL计，所述各组分的含量为：5.如权利要求1-4任一项所述的游离DNA保存液，其特征在于，所述游离DNA保存液的pH值范围为5.5～7.0。6.如权利要求1-5任一项所述的游离DNA保存液，其特征在于，所述pH稳定剂可以是Tris-HCl缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。7.如权利要求1-6任一项所述的游离DNA保存液，其特征在于，所述游离DNA保存液与保存样品的...

【专利技术属性】
技术研发人员：章文羿，李钰璨，黄清瑞，李晶，陈东海，
申请(专利权)人：北京安必奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11