乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒及其构建方法和应用。本发明专利技术利用overlapPCR技术构建了HBV前S1抗原B、C基因型抗原串联表达的pcDNA3.1(‑)质粒，该串联重组质粒可以在HEK293细胞中同时重组表达HBV B基因型前S1抗原和HBV C基因型前S1抗原。本发明专利技术的重组质粒表达的蛋白可以同时结合针对前S区HBV B基因型和HBV C基因型的抗体，能够高效完成针对HBV B基因型、C基因型抗体的筛选，为同时针对HBV B基因型和C基因型的诊断、治疗型抗体筛选奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒及其构建方法和应用
本专利技术涉及生物制药和基因工程
，具体涉及乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒及其构建方法和应用。
技术介绍
乙型肝炎病毒(HepatitisB，HBV)感染是严重的公共卫生问题，全球约20亿人感染过HBV，有3.5亿人成为了慢性HBV感染者，其中15％-40％的HBV感染者最终发展为肝硬化或肝癌。据统计中国累计有7亿人感染HBV，1.2亿人成为病毒的携带者，每年约有60万人死于HBV感染相关的疾病。HBV感染的临床转归不仅与患者的年龄和免疫力有关，也与病毒株的基因型密切相关，研究HBV基因分型具有重要的临床意义。HBV属于嗜肝病毒的一种，核酸为部分共价闭合环状双链DNA，基因组长度在3182-3221个核苷酸，含有4个部分重叠的开放读码框：前S/S区、前C/C区、P区和X区。根据HBV全基因序列异质性≥8％的界线，可将其分为A—I九种不同的基因型。S区基因序列可分为前S1区、前S2区和S区，各有起始密码子ATG，编码大、中、小3种包膜蛋白。研究表明，S基因的序列相对其他序列异质性最小，更加保守；从而也可以根据S区基因序列异质性≥4％的标准区分不同的基因型。我国90％以上的慢性乙型病毒性肝炎感染者的HBV基因型为B基因型或C基因型。S区基因作为HBV感染抗体检测的原料、抗原检测的质控品、治疗性抗体亲和力检测等具有重要的功能，因此HBV的前S蛋白在HBV诊断和治疗药物开发中具有重要的研究和应用价值。现阶段市场上，针对HBV前S蛋白的抗原为HBVB基因型和C基因型分别表达的两个蛋白且主要为原核表达，而国内开发诊断性试剂盒和治疗性生物药均需要针对B基因型和C基因型，因此在试剂盒开发和药物标准品选择方面，需要同时将两个单独的抗原混合使用，进而开发检测试剂盒、筛选药物等。导致检测试剂盒配制麻烦，且分别生产两个抗原的成本也较高，这样既增加了工作量，也提高相关检测的成本。此外，原核表达的抗原蛋白，由于缺乏部分修饰，较难作为标准品进行药物的定量。例如CN106282234B公开了一种携带人C基因型乙型肝炎病毒的表面抗原S基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用，是将人C基因型乙型肝炎病毒的表面抗原基因(HBVCS基因)插入已经剔除结构基因并带有启动子的腺相关病毒载体中获得的。该重组腺相关病毒载体可将其携带的HBVCS基因输送入单核细胞树突状细胞系中，被用于刺激免疫系统的效应细胞，从而杀灭被HBVC病毒感染的细胞，可被用于制备抗HBVC病毒感染的药物。但在此专利中，仅能表达单一HBV抗原，无法满足同时表达HBVB、C基因前S1抗原的需求。由于HBVB基因型S抗原和HBVC基因型S抗原在开发HBV诊断抗原试剂盒质控品和同时针对B、C基因型HBV感染治疗性抗体等方面具有较大的用途，因此，有必要研发一种能同时表达HBVB、C基因前S1抗原的方法或系统。
技术实现思路
针对现有技术存在的不足，本专利技术要解决的技术问题是利用重叠延伸PCR技术(genesplicingbyoverlapextensionPCR，overlapPCR)构建了HBV前S1抗原B、C基因型抗原串联表达的pcDNA3.1(-)质粒。该串联重组质粒可以在HEK293细胞中同时重组表达HBVB基因型前S1抗原和HBVC基因型前S1抗原，本专利技术可为开发诊断HBV抗原试剂盒和HBV治疗性抗体筛选试剂盒的研发提供重要的基础。为解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒，是根据人乙型肝炎病毒B基因型的前S1抗原基因和C基因型的前S1抗原基因的核苷酸序列，分别设计HBVB基因型抗原扩增引物、HBVC基因型抗原扩增引物和Overlap引物，并在HBVB基因型抗原扩增引物中插入信号肽、linker连接肽和StrepII-tag，在HBVC基因型抗原扩增引物中插入linker连接肽和6×Histag，在Overlap引物中插入限制性内切酶酶切位点；通过PCR分别扩增出HBVB、C基因型的前S1抗原序列，采用OverlapPCR将两段序列串联合成最佳表达核苷酸序列，如SEQIDNO:7所示；以pcDNA3.1(-)质粒为载体，在pcDNA3.1(-)的限制性酶切位点NheI和NotI之间插入最佳表达核苷酸序列，构建乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒。其中，所述的信号肽的氨基酸序列为MKWVTFISLLFLFSSAYSKA；所述的linker连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。本专利技术所述的HBVB、C基因型的前S1抗原序列中含有两个纯化标签strep-II和His，双标签可在两个抗原的N端和C端随机组合，能够实现两次柱纯化提高抗原纯度(优选地，StrepII-tag放在HBVB基因型前S1抗原的C末端，6×Histag放在HBVC基因型前S1抗原的C末端)；两个抗原之间具有连接氨基酸序列3X(GGGGS)保证抗原表达时的正确折叠。优选地，所述的HBVB基因型抗原扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1-2所示，所述的HBVC基因型抗原扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3-4所示，所述的Overlap引物的核苷酸序列如SEQIDNO:5-6所示。优选地，所述的重组质粒的转染范围包括但不限于真核细胞系HEK293F。另一方面，本专利技术提供了上述乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒的构建方法，包括如下步骤：S1.根据人HBVB基因型前S1抗原基因、人HBVC基因型前S1抗原基因的核苷酸序列，分别设计HBVB基因型抗原扩增引物、HBVC基因型抗原扩增引物和Overlap引物，优化信号肽及linker连接肽序列；S2.以HBVB、C基因型的基因组为模板，采用HBVB基因型抗原扩增引物、HBVC基因型抗原扩增引物分别进行PCR扩增，得到目的片段并回收；S3.通过OverlapPCR串联目的片段，采用Overlap引物进行扩增得到最佳表达核苷酸序列，如SEQIDNO:7所示；S4.将OverlapPCR纯化产物和pcDNA3.1(-)载体分别利用NheI和NotI进行酶切，回收酶切片段并采用T4连接酶进行连接；将连接产物经转化，筛选阳性克隆并测序鉴定，得到乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒。优选地，所述人HBVB基因型前S1抗原基因的PCR扩增体系包括：2×高保真PCR酶25μL，HBVB基因型抗原扩增引物各2μL，模板DNA2μL，ddH2O19μL；PCR反应程序为：98℃，2min；98℃，10s，58℃20s，72℃60s，35cycle，72℃，5min。优选地，所述人HBVC基因型前S1抗原基因的PCR扩增体系包括：2×高保真PCR酶25μL，HBVC基因型抗原扩增引物各2μL，模板DNA2μL，ddH2O19μL；PCR反应程序为：98℃，2min；98℃，10s本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒，其特征在于，是根据人乙型肝炎病毒B基因型的前S1抗原基因和C基因型的前S1抗原基因的核苷酸序列，分别设计HBVB基因型抗原扩增引物、HBV C基因型抗原扩增引物和Overlap引物，并在HBV B基因型抗原扩增引物中插入信号肽、linker连接肽和StrepII-tag，在HBV C基因型抗原扩增引物中插入linker连接肽和6×Histag，在Overlap引物中插入限制性内切酶酶切位点；通过PCR分别扩增出HBV B、C基因型的前S1抗原序列，采用Overlap PCR将两段序列串联合成最佳表达核苷酸序列，如SEQ ID NO:7所示；以pcDNA3.1(-)质粒为载体，在pcDNA3.1(-)的限制性酶切位点NheI和NotI之间插入最佳表达核苷酸序列，构建乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒，其特征在于，是根据人乙型肝炎病毒B基因型的前S1抗原基因和C基因型的前S1抗原基因的核苷酸序列，分别设计HBVB基因型抗原扩增引物、HBVC基因型抗原扩增引物和Overlap引物，并在HBVB基因型抗原扩增引物中插入信号肽、linker连接肽和StrepII-tag，在HBVC基因型抗原扩增引物中插入linker连接肽和6×Histag，在Overlap引物中插入限制性内切酶酶切位点；通过PCR分别扩增出HBVB、C基因型的前S1抗原序列，采用OverlapPCR将两段序列串联合成最佳表达核苷酸序列，如SEQIDNO:7所示；以pcDNA3.1(-)质粒为载体，在pcDNA3.1(-)的限制性酶切位点NheI和NotI之间插入最佳表达核苷酸序列，构建乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒。


2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒，其特征在于，所述的信号肽的氨基酸序列为MKWVTFISLLFLFSSAYSKA；所述的linker连接肽的氨基酸序列为GGGGSGGGGSGGGGS。


3.根据权利要求2所述的乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒，其特征在于，所述的HBVB基因型抗原扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1-2所示，所述的HBVC基因型抗原扩增引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3-4所示，所述的Overlap引物的核苷酸序列如SEQIDNO:5-6所示。


4.权利要求1-3任一项所述的乙型肝炎病毒B、C基因型前S1区基因串联重组质粒的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括如下步骤：
S1.根据人HBVB基因型前S1抗原基因、人HBVC基因型前S1抗原基因的核苷酸序列，分别设计HBVB基因型抗原扩增引物、HBVC基因型抗原扩增引物和Overlap引物，优化信号肽及linker连接肽序列；
S2.以HBVB、C基因型的基因组为模板，采用HBVB基因型抗原扩增引物、HBVC基因型抗原扩增引物分别进行PCR扩增，得到目的片段并回收；
S3.通过OverlapPCR串联目的片段，采用Overlap引物进行扩增得到最佳表达核苷酸序列，如SEQIDNO:7所示；
S4.将OverlapPCR纯化产物和pcDNA3.1(-)载体分别利用...

【专利技术属性】
技术研发人员：章文羿，程焕义，刘镇宁，黄清瑞，郭娇娇，尚雨寒，吴琼，李玉敏，
申请(专利权)人：北京安必奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11