利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法及其应用技术

本发明专利技术属于基因工程领域，具体涉及利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法及其应用。本发明专利技术的采用双位点敲除方法，在TK基因上设计两个sgRNA序列，针对两个位点进行切割，可高效敲除TK基因。敲除伪狂犬病毒TK基因的方法主要包括sgRNA设计、Cas9载体‑sgRNA表达载体构建、donor载体构建、质粒转染、cre酶载体转染、重组病毒纯化等过程。与传统方法相比，本发明专利技术的方法具有高精确性和低脱靶效应的优点。

【技术实现步骤摘要】
利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法及其应用
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及利用双sgRNA的CRISPR/cas9系统和Cre-loxp编辑系统敲除伪狂犬病毒TK基因的方法及其应用。
技术介绍
载体表达系统是重组疫苗研制及应用成功的关键，它不仅能携带外源基因，而且能高效表达外源基因。目前，应用于重组疫苗的活病毒载体主要包括慢病毒、腺病毒、痘病毒、杆状病毒、疱疹病毒等。猪伪狂犬病毒(PRV)属于疱疹病毒，作为病毒载体具有基因组相对较大、复制非必需区段较多、可以同时插入多个外源基因等显著优点：是一个非常理想的多价重组疫苗载体，可用于构建基因标记疫苗，实现一针多防。TK基因即UL23基因，是伪狂犬病毒的重要毒力基因，属于病毒的早期基因，也是非必须基因，缺失TK基因的PRV在神经元中的复制能力极弱。因此，利用基因工程技术敲除PRV的TK基因，可使毒株毒力下降和潜伏感染能力降低。近年来基因编辑技术发展迅速，CRISPR/Cas技术已经发展成为基因编辑的首选工具。其工作原理是通过guideRNA的引导，Cas9结合到有PAM结构的目的位点，利用Cas9蛋白对DNA双链进行切割。通过非同源末端连接(NHEJ)修复机制在切割位点引入插入或缺失，诱导基因突变或沉默。在Cas9切割DNA的同时引入具有同源臂的外源基因，就可以利用同源重组(HR)修复机制将外源基因片段插入到基因组目的位点，实现精确高效的基因编辑——敲入或敲除。然而，CRISPR/Cas敲除方法脱靶效率较高，敲除结果具有不稳定性。r>
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法。根据本专利技术具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，所述方法包括以下步骤：(1)设计伪狂犬病毒TK基因上的靶序列sgRNA1和sgRNA2，并根据sgRNA设计sgRNA双链寡聚核苷酸序列，其中，sgRNA1的核苷酸序列为GTATTTACGATGCGCAGACC(SEQIDNO.1)，sgRNA2的核苷酸序列为GCCCACGCGTGCACCTCGAG(SEQIDNO.2)；(2)将sgRNA双链寡聚核苷酸序列与Cas9载体连接，转化宿主细胞，得到重组Cas9-sgRNA载体；(3)构建含有靶向伪狂犬病毒TK基因的外源筛选基因同源重组片段的donor载体；(4)将donor载体、Cas9-sgRNA载体混合转染细胞；(5)用伪狂犬病毒感染细胞，挑取带有绿色荧光的蚀斑，纯化后得到伪狂犬病毒TK基因缺失过渡病毒；(6)转染Cre质粒，挑取不带有绿色荧光的蚀斑，纯化后得到伪狂犬病毒TK基因缺失病毒。根据本专利技术具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，步骤(1)中，在sgRNA5'端加上caccg或cacc得到正向寡核苷酸；同时根据导向序列获得互补序列在5'端加上aaac得到反向核苷酸序列，分别合成上述正反向序列，将两个序列变性、退火形成双链。sgRNA1和sgRNA2双链寡聚核苷酸序列为：SEQIDNO.3：正向寡核苷酸sgRNA1-F：5'-caccGTATTTACGATGCGCAGACC-3'；SEQIDNO.4：反向核苷酸序列sgRNA1-R：5'-aaacGGTCTGCGCATCGTAAATAC-3'；SEQIDNO.5：正向寡核苷酸sgRNA2-F：5'-caccGCCCACGCGTGCACCTCGAG-3'；SEQIDNO.6：反向核苷酸序列sgRNA2-R：5'-aaacCTCGAGGTGCACGCGTGGGC-3'。将形成的双链与Cas9载体连接，转化到感受态大肠杆菌中，涂布与AMP+LB平板，挑取阳性克隆，测序鉴定，增菌培养，提取质粒DNA，得到重组Cas9-sgRNA载体。所述Cas9载体为pX330等非病毒载体。根据本专利技术具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，步骤(2)中，donor载体中插入的序列包括TK基因左侧同源臂、loxp序列、启动子、荧光标记基因、loxp序列、右侧同源臂。根据本专利技术具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，所述启动子包含了CMV增强子和CMV启动子。Donor载体的制备方法：根据伪狂犬病毒株TK上下游基因的测序结果设计引物。上游同源臂引物加入loxp序列，当用PCR扩增时，获得伪狂犬病毒TK基因上游同源臂hm1序列并引入loxp序列，获得的序列包含了hm1和loxp。下游同源臂引物加入loxp序列，当PCR扩增时，获得伪狂犬病毒TK基因下游同源臂hm2序列并引入loxp序列，获得序列包含了hm2和loxp。用PCR扩增获得pEGEP-C1载体并引入loxp序列和酶切位点，获得序列包含了CMV增强子-CMV启动子-EGFP序列。将三个片段经融合PCR方法和酶切方法连接，胶回收后插入PMD18T载体，获得PMD18T-donor载体。根据本专利技术具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，构建含有靶向伪狂犬病毒TK基因的外源筛选基因同源重组片段的donor载体，包括以下步骤：(a)获得伪狂犬病毒TK基因上游同源臂hm1序列，并引入loxp序列，得到TKhm1-Loxp片段；(b)获得伪狂犬病毒TK基因下游同源臂hm2序列序列，并引入loxp序列和酶切位点，得到Loxp-TKhm2片段；(c)获得CMV增强子-CMV启动子-EGFP基因序列，并引入loxp序列和酶切位点，得到CMV-EGFP片段；(d)将Loxp-TKhm2片段与CMV-EGFP片段进行融合PCR，获得CMV-EGFP-Loxp-TKhm2片段；(e)使用酶切和连接酶，将TKhm1-Loxp片段、CMV-EGFP-Loxp-TKhm2片段连接得到靶向伪狂犬病毒TK基因的外源筛选基因同源重组片段；(f)用所述同源重组片段与质粒连接，得到donor载体。根据本专利技术具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，上游同源臂引物hm1引物序列为：SEQIDNO.7：TK-HM1F：5'-ATAACTAGTAATTGGTAGTTGTAGCGGTACGAGATGC-3'；SEQIDNO.8：TK-HM1R：5'-GGAATTCGCTAGCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTGCGCATCGT-3'。根据本专利技术具体实施方式的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，下游同源臂引物hm2引物序列为：SEQIDNO.9：TK-hm2F：5'-TATACGAAGTTATGCGCGTCTCCCACCGTC-3'；SEQIDNO.10：TK-hm2R：5'-CCGGGGATCCTCTAGAGATTGGTAGTCGTCGCTCT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n(1)设计伪狂犬病毒TK基因上的靶序列sgRNA1和sgRNA2，并根据sgRNA设计sgRNA双链寡聚核苷酸序列，其中，sgRNA1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1：5'-GTATTTACGATGCGCAGACC-3'，sgRNA2的核苷酸序列为SEQ ID NO.2：5'-GCCCACGCGTGCACCTCGAG-3'；/n(2)将sgRNA双链寡聚核苷酸序列与Cas9载体连接，转化宿主细胞，得到重组Cas9-sgRNA载体；/n(3)构建含有靶向伪狂犬病毒TK基因的外源筛选基因同源重组片段的donor载体；/n(4)将donor载体、Cas9-sgRNA载体混合转染细胞；/n(5)用伪狂犬病毒感染细胞，挑取带有绿色荧光的蚀斑，纯化后得到伪狂犬病毒TK基因缺失过渡病毒；/n(6)转染Cre质粒，挑取不带有绿色荧光的蚀斑，纯化后得到伪狂犬病毒TK基因缺失病毒。/n

【技术特征摘要】
1.利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)设计伪狂犬病毒TK基因上的靶序列sgRNA1和sgRNA2，并根据sgRNA设计sgRNA双链寡聚核苷酸序列，其中，sgRNA1的核苷酸序列为SEQIDNO.1：5'-GTATTTACGATGCGCAGACC-3'，sgRNA2的核苷酸序列为SEQIDNO.2：5'-GCCCACGCGTGCACCTCGAG-3'；
(2)将sgRNA双链寡聚核苷酸序列与Cas9载体连接，转化宿主细胞，得到重组Cas9-sgRNA载体；
(3)构建含有靶向伪狂犬病毒TK基因的外源筛选基因同源重组片段的donor载体；
(4)将donor载体、Cas9-sgRNA载体混合转染细胞；
(5)用伪狂犬病毒感染细胞，挑取带有绿色荧光的蚀斑，纯化后得到伪狂犬病毒TK基因缺失过渡病毒；
(6)转染Cre质粒，挑取不带有绿色荧光的蚀斑，纯化后得到伪狂犬病毒TK基因缺失病毒。


2.根据权利要求1所述的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，其特征在于，步骤(1)中，sgRNA1和sgRNA2双链寡聚核苷酸的序列为：
SEQIDNO.3：正向寡核苷酸sgRNA1-F：
5'-caccGTATTTACGATGCGCAGACC-3'；
SEQIDNO.4：向核苷酸序列sgRNA1-R：
5'-aaacGGTCTGCGCATCGTAAATAC-3'；
SEQIDNO.5：正向寡核苷酸sgRNA2-F：
5'-caccGCCCACGCGTGCACCTCGAG-3'；
SEQIDNO.6：反向核苷酸序列sgRNA2-R：
5'-aaacCTCGAGGTGCACGCGTGGGC-3'。


3.根据权利要求1所述的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，其特征在于，步骤(3)中，donor载体中插入的序列包括TK基因左侧同源臂、loxp序列、启动子、荧光标记基因、loxp序列、右侧同源臂。


4.根据权利要求3所述的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，其特征在于，所述启动子包含了CMV增强子和CMV启动子。


5.根据权利要求1～4任一项所述的利用双sgRNA敲除伪狂犬病毒TK基因的方法，其特征在于，构建含有靶向伪狂犬病毒TK基因的外源筛选基因同源重组片段的donor载体，包括以下步骤：
(a)获得伪狂犬病毒TK基因上游同源臂hm1序列，并引入loxp...

【专利技术属性】
技术研发人员：张莉，鄢明华，路超，任卫科，李秀丽，王利丽，董志民，李富强，田向学，江珊，李程，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：天津;12