人源化IL-10和IL-10RA基因改造动物的构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及人源化基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及表达人源化IL‑10和/或IL‑10RA蛋白的动物模型。本发明专利技术还提供了一种人源化IL‑10RA蛋白、一种人源化IL‑10RA基因、一种人源化IL‑10基因、IL‑10基因的靶向载体以及IL‑10RA基因的靶向载体。本发明专利技术还提供了一种上述动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

【技术实现步骤摘要】
人源化IL-10和IL-10RA基因改造动物的构建方法和应用
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化IL-10和/或IL-10RA基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。
技术介绍
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanizedanimalmodel)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白的氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。白介素10(Interleukin10，IL-10)基因定位于染色体1q31-32上，主要由单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞产生，此外DC细胞和肥大细胞也可以产生。IL-10蛋白属于同源二聚体分泌物，由2个亚基组成，分子量大小为18kDa。其生理功能主要分两个方面：①免疫抑制剂，通过下调MHCII类分子和ICAM-1、B7等共刺激分子的表达，抑制单核/巨噬细胞的抗原呈递细胞(APC)功能，抑制炎性细胞因子TNF、IL1、IL6和IL8的分泌；②免疫激动剂，刺激NK细胞活性，增强IL2诱导的NK细胞增殖、细胞毒性和细胞因子的产生，同时也是B淋巴细胞强有力的增殖分化因子，促进IgM、IgG、IgA亚型的合成，促进外周血记忆B细胞浆细胞的生成。IL-10发挥其生物学效应需要与IL-10受体(IL-10R)结合，有功能的IL-10R由两个特殊的亚单位组成：IL-10RA和IL-10RB，其中IL-10RA是一个110kDa的多肽，在介导高亲和力配体结合和信号转导中发挥重要作用；IL-10RB为40kDa的多肽，仅为信号转导所必须。作为目前公认的炎症与免疫抑制因子，IL-10和IL-10RA在疾病研究方面的应用非常广泛。研究表明，其在肿瘤、感染、器官移植、造血系统及心血管系统中发挥着重要作用，同时也与血液、消化、尤其是心血管系统疾病密切相关。例如，有研究证明哮喘和过敏性鼻炎患者呼吸道中IL-10表达量较健康受试者低；IL-10敲除小鼠可生成慢性结肠炎；结直肠癌和癌旁组织中IL-10表达升高；IL-10RA基因功能缺陷致极早发型炎症性肠病(VEO-IBD)患儿肠道菌群紊乱；IL-10RA多态性与系统性红斑狼疮的发病相关等等。基于IL-10及其受体的重要功能，目前已经有多种靶向药物进入临床。例如Merck的MK-1966与TLR9拮抗剂联合用于恶性肿瘤的治疗(NCT02731742)；BiotestAG的BT-063与PD-1抗体联和用于黑色素瘤的治疗(WO2019072566)等。此外，还有通过腺病毒载体或聚乙二醇化的IL-10药物用于肿瘤治疗，比如ARMOBioSciences和Merck联合开发的Pegilodecakin。鉴于IL-10信号通路在免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了进一步的研究相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发涉及IL-10信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化的非人动物，如与免疫检查点人源化小鼠交配得到多基因人源化的动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本专利技术在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。本专利技术在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的第一方面，提供了一种人源化IL-10RA蛋白，所述的人源化IL-10RA蛋白包括人IL-10RA蛋白区域。优选的，包含胞外区的全部、信号肽的全部、跨膜区的全部和胞内区的部分，其中胞内区的部分至少包含胞内区N端1-10个氨基酸。进一步优选的，包含SEQIDNO：28第1-264位所示氨基酸序列。优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白还包括非人动物IL-10RA蛋白区域。优选的，所述的人IL-10RA蛋白区域包括人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列编码的蛋白的全部或部分。进一步优选的，所述的第1至6号外显子核苷酸序列编码的蛋白的部分至少包含人IL-10RA蛋白胞外区的全部或部分，所述的胞外区的部分为至少10个或至少20或至少30与人IL-10RA蛋白的胞外区氨基酸序列相同且可以结合靶向人特定抗原的抗体。优选的，所述的人IL-10RA蛋白区域包括人IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列、第5号外显子核苷酸序列或第6号外显子核苷酸序列中的任一个或两个或三个以上的组合编码的蛋白的全部或部分。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个、五个或六个。进一步优选的，所述的人IL-10RA蛋白区域包括人IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列、第5号外显子核苷酸序列或第6号外显子核苷酸序列中的连续两个或连续三个以上外显子核苷酸序列的组合编码的蛋白的全部或部分。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个、五个或六个。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人IL-10RA蛋白区域包括人IL-10RA基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至5号外显子的全部核苷酸序列和第6号外显子的部分核苷酸序列编码的蛋白的全部或部分。优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白的氨基酸序列包括SEQIDNO：28第1-264位所示氨基酸序列的全部或部分。优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白的氨基酸序列连续5个氨基酸至连续264个氨基酸与人IL-10RA蛋白的氨基酸序列一致。进一步优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白的氨基酸序列连续10、20、30、40、50、70、80、100、150、180个氨基酸至连续200个氨基酸与人IL-10RA蛋白的氨基酸序列一致。进一步优选的，所述的胞外区来源于人IL-10RA蛋白胞外区的全部或部分，更进一步优选的，所述的胞外区氨基酸序列包含SEQIDNO：28第22-235位所示氨基酸序列的全部或部分。优选的，所述的胞外区氨基酸序列至少本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含IL-10RA基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化IL-10RA蛋白，同时内源IL-10RA蛋白表达降低或缺失。/n

【技术特征摘要】
20191111 CN 20191109582021.一种包含IL-10RA基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化IL-10RA蛋白，同时内源IL-10RA蛋白表达降低或缺失。


2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL-10RA蛋白包含人IL-10RA蛋白的胞外区的全部、信号肽的全部、跨膜区的全部和胞内区的部分，其中胞内区的部分至少包含胞内区N端1-10个氨基酸，优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白包含下列组中的一种：
A)SEQIDNO：32所述氨基酸序列的部分或全部；
B)与SEQIDNO：32所示氨基酸的序列同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQIDNO：32所示的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
D)具有SEQIDNO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包括人IL-10RA基因的部分，优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL-10RA蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码SEQIDNO:28第1-264位氨基酸的核苷酸序列。


4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含人源化IL-10RA基因，优选的，所述的人源化IL-10RA基因包含下列组中的一种：
(a)NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列；
(b)转录的mRNA序列为SEQIDNO：31所示；
(c)与SEQIDNO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列的同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(d)与SEQIDNO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
(e)具有SEQIDNO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。


5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，所述的人IL-10RA基因或人源化IL-10RA基因通过内源性调控元件调控。


6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中还包括人IL-10基因的部分，优选的，包含人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码SEQIDNO:4所示氨基酸的核苷酸序列；优选的，所述的人源化非人动物体内表达人或人源化IL-10蛋白，同时内源IL-10蛋白表达降低或缺失。


7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体将人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分插入或替换至非人动物IL-10RA基因座，
优选的，将包含编码人IL-10RA蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10RA基因座，进一步优选的，将包含编码SEQIDNO:28第1-264位氨基酸的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10RA基因座；更进一步优选的，将包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10RA基因座；
优选的，所述的靶向载体包含人IL-10RA基因核苷酸序列的部分，优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列或编码SEQIDNO：28第1-264位所示氨基酸的核苷酸序列。


8.一种人源化IL-10RA蛋白，其特征在于，所述的人源化IL-10RA蛋白包括人IL-10RA蛋白区域，优选的，包含胞外区的全部、信号肽的全部、跨膜区的全部和胞内区的部分，其中胞内区的部分至少包含胞内区N端1-10个氨基酸，进一步优选的，包含SEQIDNO：28第1-264位所示氨基酸序列。


9.根据权利要求8所述的人源化IL-10RA蛋白，其特征在于，所述的人源化IL-10RA蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
A)SEQIDNO：32所述氨基酸序列的部分或全部；
B)与SEQIDNO：32所示氨基酸的序列同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQIDNO：32所示的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
D)具有SEQIDNO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。


10.一种人源化IL-10RA基因，其特征在于，所述的人源化IL-10RA基因包括人IL-10RA基因组的部分，优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL-10RA蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码SEQIDNO:28第1-264位氨基酸的核苷酸序列；优选的，包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列。


11.根据权利要求10所述的人源化IL-10RA基因，其特征在于，所述的人源化IL-10RA基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：
(a)编码权利要求8-9任一所述的人源化IL-10RA蛋白的核苷酸序列；
(b)NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列；
(c)转录的mRNA序列为SEQIDNO：31所示；
(d)与SEQIDNO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列的同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(e)与SEQIDNO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
(f)具有SEQIDNO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。


12.一种IL-10RA基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包括人IL-10RA基因核苷酸序列的部分，优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列或编码SEQIDNO：28第1-264位所示氨基酸的核苷酸序列。


13.根据权利要求12所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，
所述的5’臂选自IL-10RA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂的核苷酸序列与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQIDNO：29所示；
所述的3’臂选自IL-10RA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂的核苷酸序列与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈月雷，郭雅南，白阳，姚佳维，郭朝设，张美玲，黄蕤，赵磊，周小飞，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11