TROP2基因人源化非人动物的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种人源化TROP2蛋白、一种人源化TROP2基因、一种TROP2基因的靶向载体、一种TROP2基因人源化的非人动物及其构建方法和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人TROP2蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化TROP2蛋白，可以作为人TROP2信号机理研究、肿瘤及免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。点的新药研发具有重要的应用价值。点的新药研发具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
TROP2基因人源化非人动物的构建方法及应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种TROP2基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]TROP2是人滋养层细胞表面糖蛋白抗原，又称为肿瘤相关钙离子信号转导子(TACSTD2)，属于GA733家族成员，约35KD，为I型跨膜蛋白，包含一个大的胞外区、单次跨膜结构域和较小的胞内区。TROP2基因过表达于胚胎形成过程中的人滋养层细胞，在分层鳞状上皮、柱状上皮细胞和立方状上皮细胞均有表达，并在角膜、乳腺、宫颈、分泌腺上皮组织、心脏、食管、肾脏、喉部组织、肺、肝脏、胰腺、前列腺、皮肤、胸腺、扁桃体、气管、膀胱上皮、子宫等多种器官和组织中呈现差异性表达。但TROP2在正常组织中表达量低，在多种恶性肿瘤中过度表达，是一种可以调节肿瘤细胞生长的信号传导分子，可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移扩散等过程，与患者无进展生存期缩短和不良预后密切相关。TROP2主要通过调节钙离子信号通路、细胞周期蛋白表达及降低纤黏蛋白黏附作用促进肿瘤细胞生长、增殖和转移；也可以与Wnt信号级联中的β
‑
连环蛋白相互作用，因而对细胞核癌基因的转录、细胞的增殖起作用。人和小鼠的TROP2蛋白氨基酸序列一致性为79％。
[0003]由于TROP2在大多数人上皮实体瘤中高表达，如口腔鳞癌、头颈部肿瘤、肺癌、甲状腺肿瘤、食管瘤、胃癌、结直肠瘤、胰腺癌、乳腺癌、肾瘤、宫颈瘤、卵巢癌和神经胶质瘤等，使得其成为多种肿瘤疾病治疗药物的潜在靶点。
[0004]在药物开发过程中，利用实验动物模型进行人类药物，特别是抗体药物的发现和筛选，是非常重要的研究过程；同时，利用实验动物模型进行人类药物的药理药效等临床前研究更是不可缺少的开发步骤。但由于动物与人类在生理结构和代谢系统的差异，传统的动物模型并不能很好地反映药物在人体的真实状况，建立更接近人类生理特征的人源化动物模型是生物医药行业的迫切需求。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在的差异，加上基因的复杂性，构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是巨大的挑战。
[0005]鉴于TROP2在肿瘤疾病治疗领域的巨大应用潜力，为进一步探索相关生物学特性，并提高TROP2靶点相关药物临床前试验的有效性，降低临床研究风险，本领域急需开发TROP2相关信号通路的非人动物模型。

技术实现思路

[0006]本专利技术制备的TROP2基因人源化的非人动物可改进和提升细胞或组织移植，更重要的是，由于人类基因片段的插入，非人动物体内可表达或部分表达人TROP2蛋白，可以作为仅能识别人TROP2蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行人抗体及其他药物的筛选提供了可能。
[0007]本专利技术的第一方面，提供了一种人源化TROP2基因。
[0008]优选的，所述的人源化TROP2基因包含人TROP2基因的部分。
[0009]优选的，所述的人TROP2基因的部分包含人TROP2基因的1号外显子的全部或部分。其中，1号外显子的部分包含至少200bp到至少1820bp，例如200、500、700、900、950、970、971、972、973、974、975、1000、1500、1800或1820bp的连续核苷酸序列；优选的，1号外显子的部分包含从起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化TROP2基因包含人TROP2基因的CDS序列。
[0010]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人TROP2基因的部分包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
[0011]优选的，所述的人TROP2基因的部分包含编码人TROP2蛋白的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选包含编码人TROP2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞内区的核苷酸序列的全部或部分，更优选包含编码人TROP2蛋白至少10个到至少323个，例如10、20、23、26、30、50、100、150、200、248、250、300、310、320或323个连续氨基酸的核苷酸序列。
[0012]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人TROP2基因的部分包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
[0013]优选的，所述的人源化TROP2基因还包含非人动物TROP2基因的全部或部分。
[0014]优选包含编码非人动物TROP2蛋白的核苷酸序列，进一步优选包含编码非人动物TROP2蛋白的胞外区、跨膜区、胞质区和/或信号肽的全部或部分核苷酸序列。
[0015]优选包含非人动物TROP2基因的1号外显子的全部或部分，更优选包含非人动物TROP2基因的1号外显子的部分。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化TROP2基因包含非人动物TROP2基因的1号外显子的非编码区，或者，包含非人动物TROP2基因的3
’
UTR和/或5
’
UTR。
[0016]优选的，所述的人源化TROP2基因还包含SEQ ID NO：8和/或9所示的核苷酸序列。
[0017]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化TROP2基因从5
’
端到3
’
端依次包括非人动物TROP2基因的5
’
UTR、人TROP2基因的部分(优选包含人TROP2基因的1号外显子的部分)、非人动物TROP2基因的3
’
UTR。
[0018]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化TROP2基因从5
’
端到3
’
端依次包括非人动物TROP2基因的5
’
UTR、SEQ ID NO：7或编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列、非人动物TROP2基因的3
’
UTR。
[0019]优选的，所述的人源化TROP2基因编码人或人源化TROP2蛋白。
[0020]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化TROP2基因转录的mRNA的核苷酸序列包含下列组中的任一种：
[0021]A)SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源化TROP2基因，其特征在于，所述的人源化TROP2基因包含人TROP2基因的部分。2.根据权利要求1所述的人源化TROP2基因，其特征在于，所述的人TROP2基因的部分包含人TROP2基因的1号外显子的全部或部分，其中，1号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，优选的，1号外显子的部分包含起始密码子至终止密码子的核苷酸序列；进一步优选的，所述的人TROP2基因的部分包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。3.根据权利要求1或2所述的人源化TROP2基因，其特征在于，所述的人TROP2基因的部分包含编码人TROP2蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选的，所述的人TROP2基因的部分包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的人源化TROP2基因，其特征在于，所述的人源化TROP2基因还包含非人动物TROP2基因的部分，优选的，包含非人动物TROP2基因的5
’
UTR和/或3
’
UTR。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的人源化TROP2基因，其特征在于，所述的人源化TROP2基因转录的mRNA的核苷酸序列包含下列组中的任一种：A)SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；B)与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，D)具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。6.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含下列组中的一种：A)编码人TROP2蛋白的全部或部分的核苷酸序列；优选包含编码人TROP2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分；进一步优选包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列，或者，包含与编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；B)人TROP2基因的部分，优选人TROP2基因的1号外显子的全部或部分，其中，人TROP2基因的1号外显子的部分至少包含200bp的核苷酸序列，优选的，1号外显子的部分包含起始密码子至终止密码子的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)权利要求1
‑
5任一所述的人源化TROP2基因。7.根据权利要求6所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5
’
臂和/或3
’
臂，所述的5
’
臂与NCBI登录号为NC_000072.7至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述5
’
臂序列如SEQ ID NO：3或5所示；所述的3
’
臂与NCBI登录号为NC_000072.7至少具有90％
同源性的核苷酸；优选的，所述3
’
臂序列如SEQ ID NO：4或6所示。8.一种TROP2基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人TROP2蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人TROP2基因的部分或人源化TROP2基因；优选的，所述的人源化TROP2基因为权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄德萱，沈志远，李冲，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：