TGFBR2基因人源化非人动物及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种TGFBR2基因人源化的非人动物及其构建方法、一种人源化TGFBR2蛋白、一种人源化TGFBR2基因、一种TGFBR2基因的靶向载体、一种TGFBR2基因人源化的细胞和其在生物医药领域的应用，所述的构建方法包括利用同源重组的方式将编码人TGFBR2蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化TGFBR2蛋白，可以作为人TGFBR2信号机理研究、肿瘤及免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
TGFBR2基因人源化非人动物及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种TGFBR2基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

技术介绍

[0002]TGFBR2(transforming growth factor beta receptor 2)是一种单通道I型膜蛋白受体，在脂肪、肺和25种其他组织中广泛存在，在单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞中均有表达，尤其在嗜酸性粒细胞以及初始CD4 T细胞中高表达，组织特异性及细胞特异性低。TGFβ在哺乳动物中包括TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3三种类型。TGFβ受体超家族分为两类，分别为TGFβreceptor type 1和TGFβreceptor type 2。三型TGFβ的受体为TGFβreceptor1及TGFβreceptor2。2个TGFBR1和2个TGFBR2分子组成的受体复合物，与细胞因子二聚体对称结合，导致组成性活性TGFBR2磷酸化和激活TGFRB1。活化的TGFBR1磷酸化SMAD2，SMAD2与受体解离并与SMAD4相互作用。SMAD2
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SMAD4复合物随后易位至细胞核，在那里调节TGF
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β调节基因的转录，这构成了典型的SMAD依赖性TGF
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β信号级联反应。TGFBR2与TGFBR1形成的跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶，将TGFB1、TGFB2和TGFB3信号从细胞表面转导至细胞质，从而调节大量生理和病理过程，包括上皮细胞和造血细胞中的细胞周期停滞、间充质细胞增殖和分化控制、伤口愈合、细胞外基质生成、免疫抑制和致癌作用。TGFβ信号在肿瘤的发生和维持中起到了复杂的作用，其抑瘤和促瘤作用可能取决于肿瘤发生的阶段和肿瘤微环境，TGFβ信号在癌前病变中起到抑瘤作用，而在癌症转移中则起到了促进作用。
[0003]目前9项临床前研药物中5项为TGFBR2表达抑制剂。处于临床I期的有3项，礼来开发的LY3022859(IMC
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TR1)是一种抗TGFβR2 IgG1单克隆抗体，可抑制受体介导的信号激活；默克公司的靶向PD
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L1(CD274)和TGFBR2受体的胞外端的双功能融合蛋白M7824(MSB0011359 C)在晚期实体瘤中的I期试验，江苏恒瑞紧随其后，在研药物SHR
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1701也处于I期临床开发，为双功能融合蛋白，由靶向PD
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L1(CD274)的单克隆抗体与TGFBR2的胞外域融合组成，用于治疗转移性或局部晚期实体瘤，包括复发性或转移性鼻咽癌。
[0004]随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，例如，人和小鼠TGFBR2蛋白的一致性为92％，而主要功能域的同一性为87％，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
[0005]鉴于TGFBR2复杂的作用机制，以及在肿瘤治疗领域的巨大应用价值，为进一步探
索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发TGFBR2相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本专利技术在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种TGFBR2基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化TGFBR2蛋白。
[0007]优选的，所述的非人动物的内源TGFBR2蛋白表达降低或缺失。
[0008]优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2蛋白的全部或部分。
[0009]优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。
[0010]优选的，所述人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2的胞外区的全部或部分，其中，所述的人TGFBR2的胞外区的部分包含人TGFBR2胞外区至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、135、138、140、144、150、151、152、153、154、160、161个连续氨基酸。
[0011]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述人源化TGFBR2蛋白包含SEQ ID NO：2第23
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166位或SEQ ID NO：44第29
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182位所示的氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：2第23
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166位或SEQ ID NO：44第29
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182位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第23
‑
166位或SEQ ID NO：44第29
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182位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第23
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166位或SEQ ID NO：44第29
‑
182位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0012]优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2信号肽的全部或部分。
[0013]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述的人源化TGFBR2蛋白包含SEQ ID NO：2的第1
‑
22位所示的氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：2的第1
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22位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2的第1
‑
22位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2的第1
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22位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
[0014]优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2的胞外区的全部或部本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种TGFBR2基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化TGFBR2蛋白，所述的非人动物基因组包含人或人源化TGFBR2基因。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2蛋白的全部或部分，优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分；进一步优选的，所述人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2的胞外区的全部或部分；更优选的，所述的人TGFBR2的胞外区的部分包含人TGFBR2胞外区至少50个连续氨基酸；更进一步优选的，包含SEQ ID NO：2第23
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166位或SEQ ID NO：44第29
‑
182位所示的氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：2第23
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166位或SEQ ID NO：44第29
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182位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第23
‑
166位或SEQ ID NO：44第29
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182位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第23
‑
166位或SEQ ID NO：44第29
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182位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，进一步优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2信号肽的全部或部分；更优选的，包含SEQ ID NO：2的第1
‑
22位所示的氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：2的第1
‑
22位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2的第1
‑
22位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2的第1
‑
22位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2的胞外区的全部或部分；优选的，包含人TGFBR2胞外区至少50个连续氨基酸，优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白还包含非人动物TGFBR2蛋白的胞外区的部分、跨膜区的全部、信号肽的全部和胞质区的全部；优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白包含SEQ ID NO：43第1
‑
28和183
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592位所示的氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：43第1
‑
28和183
‑
592位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：43第1
‑
28和183
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592位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：43第1
‑
28和183
‑
592位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的人源化TGFBR2蛋白，其特征在于，所述的人源化TGFBR2蛋白包含人TGFBR2的胞外区的全部或部分和信号肽的全部或部分，优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白还包含非人动物TGFBR2的跨膜区的部分和胞质区的全部；优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白包含SEQ ID NO：1的第167
‑
567位所示的氨基酸序列，或者，包含与SEQ ID NO：1的第167
‑
567位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1的第167
‑
567位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1的第167
‑
567位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
5.根据权利要求1
‑
4任一所述的人源化TGFBR2蛋白，其特征在于，所述的人源化TGFBR2蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：A)SEQ ID NO：2第1
‑
166位或SEQ ID NO：44第29
‑
182位所示氨基酸序列；B)与SEQ ID NO：2第1
‑
166位或SEQ ID NO：44第29
‑
182位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；C)与SEQ ID NO：2第1
‑
166位或SEQ ID NO：44第29
‑
182位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，D)与SEQ ID NO：2第1
‑
166位或SEQ ID NO：44第29
‑
182位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，优选的，所述的人源化TGFBR2蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：a)为SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：53的全部或部分；b)与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：53的氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：53的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，d)与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：53所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。6.根据权利要求1
‑
5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含人TGFBR2基因的全部或部分；优选的，包含人TGFBR2基因的1号至8号外显子的全部或部分，进一步优选包含人TGFBR2基因的1号至8号外显子中的一种、两种或三种以上的组合，更进一步优选包含人TGFBR2基因的1号至5号外显子的全部或部分。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含人TGFBR2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化TGFBR2基因还包含非人动物TGFBR2基因的部分，进一步优选包含非人动物TGFBR2基因的1号外显子的部分、5号外显子的部分和6号至8号外显子的全部。8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含人TGFBR2基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部、3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化TGFBR2基因还包含非人动物TGFBR2基因的部分，优选包含非人动物TGFBR2基因的1号外显子的全部或部分、2号外显子的全部或部分、4号外显子的部分、5号外显子的全部、6号外显子的全部、7号外显子的全部。9.根据权利要求6
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8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：47所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
10.根据权利要求1
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9任一所述的构建方法，其特征在于，人TGFBR2基因的部分或人源化TGFBR2基因在非人动物体内通过内源调控元件进行调控。11.根据权利要求1
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10任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物TGFBR2基因座上，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的任一种：A)编码人或人源化TGFBR2蛋白的核苷酸序列；B)编码人TGFBR2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分；优选包含编码胞外区的全部或部分的核苷酸序列；进一步优选还包含编码信号肽的核苷酸序列；更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1
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166位或SEQ ID NO：44第29
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182位氨基酸的核苷酸序列；再进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：53的核苷酸序列；C)人或人源化TGFBR2基因的核苷酸序列；或，D)人TGFBR2基因的1号至8号外显子的全部或部分，优选的，人TGFBR2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列；再进一步优选的，包含SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列；E)人TGFBR2基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选的，人TGFBR2基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部、3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，4号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列；更进一步优选的，包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。12.根据权利要求11所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入。13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述的导入非人动物TGFBR2基因座为替换非人动物的TGFBR2基因的1号至8号外显子的全部或部分；进一步优选为替换非人动物TGFBR2基因的相应位置，更进一步优选为1号至5号外显子的全部或部分；或者，进一步优选为替换非人动物TGFBR2基因的2号外显子的全部或部分。14.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述的导入非人动物TGFBR2基因座为插入非人动物TGFBR2基因的1号至8号外显子的全部或部分，优选为插入非人动物TGFBR2基因的1号外显子起始密码子上。15.根据权利要求1
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14任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体进行非人动物的构建；优选的，所述的靶向载体包括供体核苷酸序列，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的任一种：A)编码人或人源化TGFBR2蛋白的核苷酸序列；B)编码人TGFBR2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分；优选包含编码胞外区的全部或部分的核苷酸序列；进一步优选还包含编码信号肽的核苷酸序列；更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1
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166位或SEQ ID NO：44第29
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182位氨基酸的核苷酸序列；再进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：53的核苷酸序列；C)人或人源化TGFBR2基因的核苷酸序列；或，
D)人TGFBR2基因的1号至8号外显子的全部或部分，优选的，人TGFBR2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，5号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列；再进一步优选的，包含SEQ ID NO：47所示的核苷酸序列；E)人TGFBR2基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选的，人TGFBR2基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部、3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，1号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列，4号外显子的部分包含编码胞外区的核苷酸序列；更进一步优选的，包含SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。16.根据权利要求15所述的构建方法，其特征在于，所述的靶向载体还包含5
’
臂和/或3
’
臂；所述的5
’
臂与NCBI登录号为NC_000075.7至少具有90％同源性的核苷酸；优选的，所述5
’
臂序列如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：45所示；所述的3
’
臂与NCBI登录号为NC_000075.7至少具有90％同源性的核苷酸；更进一步优选的，所述的3
’
臂序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：46所示。17.根据权利要求1
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16任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法进一步包括将TGFBR2基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自PD
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1、PD
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L1、CD27、CD40、CD73、CD226、OX40、4
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1BB、LAG3、TIGIT中的至少一种，优选的，所述的人源化TGFBR2基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为纯合的；优选的，所述的人源化TGFBR2基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为杂合的。18.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：A)编码人或人源化TGFBR2蛋白的核苷酸序列；B)编码人TGFBR2蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分；优选包含编码胞外区的全部或部分的核苷酸序列；进一步优选还包含编码信号肽的核苷酸序列；更进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：2第1
‑
166位或SEQ ID NO：44第29
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182位氨基酸的核苷酸序列；再进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：53的核苷酸序列；C)人或人源化TGFBR2基因的核苷酸序列；或，D)人TGFBR2基因的1号至8号外显子的全部或部分，优选的，人TGFBR2基因的1号外显子的部分、2号至4号外显子的全部和5号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含5bp的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙晓霞，周小飞，
申请(专利权)人：百奥赛图北京医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：