过表达Rassf2基因调控内耳毛细胞增殖的应用制造技术

本发明专利技术公开过表达Rassf2基因调控内耳毛细胞增殖的应用，属于生物技术领域，包括一种Rassf2基因小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：步骤一：构建Rassf2

【技术实现步骤摘要】
过表达Rassf2基因调控内耳毛细胞增殖的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及过表达Rassf2基因调控内耳毛细胞增殖的应用。

技术介绍

[0002]听力损伤是一种普遍存在的感觉缺失的疾病，随着人口老龄化，药物滥用以及噪音污染耳聋人群逐年上升，耳聋已经成为了一种全球性的健康问题，其中感音神经性聋占的比例较大。感音神经性聋主要是由于内耳毛细胞的损伤，在成熟的哺乳动物中，一旦毛细胞缺失就缺乏再生能力。
[0003]Rassf2基因是Ras相关结构域家族蛋白之一，Rassf2基因也是Hippo信号通路关键调节因子。H i ppo信号通路调节许多生物学功能，包括细胞生长和命运决定，器官大小控制和再生。H ippo通路的调控因子控制参与细胞增殖，存活，迁移，干性和分化多种生物学过程。目前通过激活或抑制某一信号通路从而促进内耳干细胞的再生已成为研究的热点，但是通过单基因调控内耳干细胞再生方面还未报道，
[0004]人工耳蜗是目前用于治疗感音神经性耳聋的主要手段，人工耳蜗是一种电子装置，由体外言语处理器将声音转换为一定编码形式的电信号，通过植入体内的电极系统直接兴奋听神经来恢复或重建聋人的听觉功能。也有研究表明可通过调控单个的Wnt或Notch信号通路使部分支持细胞再生毛细胞，但是效果并不理想。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供过表达Rassf2基因调控内耳毛细胞增殖的应用，通过在小鼠内耳支持细胞中特异性的过表达Rassf2基因来促进内耳干细胞增殖，从而为临床中改善听力损失提供理论基础。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
[0007]一种Rassf2基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008]步骤一：构建Rassf2
loxp/loxp
过表达小鼠和Lgr5
Cre/ER
小鼠；
[0009]步骤二：再将Rassf2
loxp/loxp
与Lgr5
Cre/ER
小鼠交配；
[0010]步骤三：获得新生的Rassf2
loxp/loxp
Lgr5
Cre/ER
小鼠，并在出生后的第一天激活Cre酶表达，出生后第七天收取小鼠基底膜；
[0011]步骤四：在将基底膜三个部分，分别进行免疫荧光染色，标记毛细胞，染色后进行拍摄，最后对增多毛细胞进行统计。
[0012]进一步的，构建Lgr5
Cre/ER
小鼠作为对照组。
[0013]进一步的，所述步骤四中标记抗体为myos i n7a抗体。
[0014]进一步的，第一天通过注射他莫昔芬激活酶表达。。
[0015]进一步的，将所述基底膜分成顶、中、底转三个部分。
[0016]进一步的，所述步骤三中通过基因型鉴定的方式鉴定获得双阳性小鼠。
[0017]一种Rassf2基因小鼠模型的构建方法在过表达Rassf2基因调控内耳毛细胞增值上的应用。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术在Rassf2
loxp/loxp
和Lgr5
Cre/ER
单基因小鼠的条件下，成功构建了在内耳中条件性过表达Rassf2双阳性小鼠，而非全身性过表达。过表达Rassf2基因后通过免疫荧光手段检测到内耳毛细胞增多。
附图说明
[0020]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0021]图1是Rassf2小鼠构建，双阳性小鼠基因型鉴定；
[0022]图2是Rassf2基因在内耳中过表达；
[0023]图3是双阳性小鼠毛细胞增多；
[0024]图4是内外毛细胞在顶、中、底转中统计。
具体实施方式
[0025]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0026]如图1～4所示，本申请的一个示例中，公开了一种小鼠模型的构建方法。
[0027]一、Rassf2在内耳支持细胞特异性表达小鼠的构建
[0028]通过CRI SPR/Cas9技术构建Rassf2
loxp/loxp
过表达小鼠，再将Rassf2
loxp/loxp
与Lgr5
Cre/ER
小鼠交配获得Rassf2
loxp/loxp
Lgr5
Cre/ER
双阳性小鼠。通过基因型鉴定的方式鉴定获得双阳性小鼠(图1)。新生的Rassf2
loxp/loxp
Lgr5
Cre/ER
在出生后的第一天(P1)注射他莫昔芬(Tamoxifen)激活Cre酶表达，从而使Rassf2基因特异性在内耳支持细胞过表达。通过Q
‑
PCR检测Rassf2基因在内耳中过表达。
[0029]二、Rassf2过表达后毛细胞增殖
[0030]新生的Rassf2
loxp/loxp
Lgr5
Cre/ER
在出生后的第一天(P1)注射他莫昔芬(Tamoxifen)，出生后第七天(P7)收取小鼠基底膜。并且通过基因型鉴定出Rassf2
loxp/loxp
Lgr5
Cre/ER
双阳性小鼠，以及Lgr5
Cre/ER
小鼠作为对照组。在显微镜下解剖将基底膜分成顶、中、底转三个部分，分别进行免疫荧光染色，用myos i n7a抗体标记毛细胞。染色后通过LSM700进行拍摄，最后对增多的顶、中、底三转的毛细胞进行统计。
[0031]如图1所示，利用CRISPR/Cas9打靶技术在小鼠染色体上加入rassf2基因片段以及l oxp酶位点后，通过交配后获得Rassf2
loxp/lopx
小鼠，再与Lgr5
Cre/ER
小鼠交配繁殖获得Rassf2
loxp/lopx
Lgr5
Cre/ER
双阳性小鼠，即图中基因型鉴定结果，含有Rassf2 mutant的条带以及Lgr5双杂合条带的小鼠。
[0032]如图2所示，新生小鼠出生后第一天皮下注射Tamoxifen激活Cre酶的活性从而切
除l oxp位点使得rassf2基因过表达后，第七天收取小鼠耳蜗组织，提取RNA进行QPCR实验检测对照组Lgr5
Cre/ER
和Rassf2
loxp/l本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种Rassf2基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：构建Rassf2
loxp/loxp
过表达小鼠和Lgr5
Cre/ER
小鼠；步骤二：再将Rassf2
loxp/loxp
与Lgr5
Cre/ER
小鼠交配；步骤三：获得新生的Rassf2
loxp/loxp
Lgr5
Cre/ER
小鼠，并在出生后的第一天激活Cre酶表达，出生后第七天收取小鼠基底膜；步骤四：在将基底膜三个部分，分别进行免疫荧光染色，标记毛细胞，染色后进行拍摄，最后对增多毛细胞进行统计。2.根据权利要求1所述的一种Rassf2基因小鼠模型的...

【专利技术属性】
技术研发人员：柴人杰，江佩，张莎莎，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：