基因敲除及试剂盒制造技术

基因敲除及试剂盒。选定待敲除基因的编码区的至少两个目标序列，使其分别包含完整的目标密码子CAA、CAG或CGA；利用至少两个sgRNA序列来将BE3定位到相应的目标序列以使目标密码子中的目标单碱基C变成T从而相应引入终止密码子TAA或TAG、TGA以实现基因敲除；所述至少两个sgRNA序列为分别与所述至少两个目标序列互补对应的序列，其中所述至少两个sgRNA被共注射以实现同一基因的有效敲除。本发明专利技术提供了一种更高效，且具有高精确性和低脱靶效应的基因敲除方法。

【技术实现步骤摘要】
基因敲除及试剂盒本申请是基于申请号为“201811113109.0”、申请日为2018年9月25日、专利技术名称为“通过多条sgRNA共注射实现同一基因有效敲除”的专利技术申请而提出的分案申请。
本专利技术涉及基于碱基编辑的基因敲除方法策略的改进及其应用。
技术介绍
基因编辑技术指对目标基因进行“编辑”，将期望的变化引入基因组DNA的靶位点的过程。早期的基因编辑是通过发现内源性同源重组来实现的。然而，传统的真核生物靶向基因操作具有基因打靶效率低，应用范围有限等缺点。II型CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats-associatedCas9endonuclease)系统的发现与应用打破了原有限制，该系统被证明是一种多用途基因编辑的工具[Leetal.,2013；Patricketal.,2014]。CRISPR/Cas9系统介导特异性基因敲除(knockout)是利用sgRNA(singleguidedRNA)通过靶序列互补引导Cas9蛋白定位剪切双链DNA，发生非同源末端连接(non-homologousendjoining,NHEJ)修复，造成移码突变(frameshiftmutation)，导致基因敲除，该方法在实际应用上主要有以下缺点：首先非同源性末端接合机制容易产生随机插入和删除(indel)，使得在断裂点附近可能随机引入新的碱基，从而导致不精确的基因编辑。其次，CRISPR/Cas9介导的基因编辑总有一些脱靶效应[Gorskietal.,2017]。最新研究表明，基于CRISPR/Cas9技术所构建的Cas9和脱氨酶的融合蛋白可作为“碱基编辑器(Baseeditor，BE)”。第一代碱基编辑(BE1)是通过将大鼠胞苷脱氨酶ApOBEC1融合到dCas9,它通过脱氨基作用将C/G碱基对改变为A/T。此后为提高其编辑效率对BE系统进行了各种修改，目前应用较为广泛的BE3可以在sgRNA的非结合链的位置4-8碱基的窗口中引入C-T核苷酸替换[Komoretal.,2016]。这为实现基因敲除提供了新的思路——通过CT突变引入终止密码子，例如将CAA、CAG、CGA突变成终止密码子TAA、TAG、TGA，或通过GA突变将TGG突变成终止密码子TAA、TGA、TAG，终止编码基因的翻译，从而实现基因敲除。它提供了比Cas9介导的NHEJ更安全和更精确的敲除策略[Komoretal.,2017；Kimetal.,2017]。然而由于受到BE3编辑效率等因素的限制目前并没有通过该方法获得基因有效敲除的实例。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种高效精准的基因敲除策略。根据本专利技术的第一方面，提供了一种基因敲除方法，其包括：选定待敲除基因的编码区的至少两个19～21bp-NGG目标序列，使其分别包含完整的目标密码子CAA、CAG或CGA，其中的目标单碱基C位于目标序列的第4-8位，目标密码子与NGG间隔12-14bp；利用至少两个sgRNA序列来将BE3定位到相应的目标序列以使目标密码子中的目标单碱基C变成T从而相应引入终止密码子TAA或TAG、TGA以实现基因敲除；所述至少两个sgRNA序列为分别与所述至少两个目标序列互补对应的19～21bp序列，其中所述至少两个sgRNA被共注射以实现同一基因的有效敲除。在替代方案中，可以选定待敲除基因的编码区的CCN-19～21bp目标序列，使其包含完整的目标密码子TGG,目标单碱基G优选位于目标序列的(右端)第4-8位，目标密码子与NGG间隔12-14bp。根据本专利技术，BE3可以为rAPOBEC-SpCas9-NLS-UGI-NLS。根据本专利技术的方法可以用于敲除如下两个靶基因：小鼠Pcdc1和Tyr。根据本专利技术的第二方面，提供了上述方法在细胞系N2a进行小鼠Pcdc1和Tyr基因敲除的应用。根据本专利技术的第三方面，提供了根据上述应用而获得的有效引入终止密码子实现基因敲除的sgRNA在小鼠胚胎细胞进行鼠Pcdc1和Tyr基因敲除的应用。根据本专利技术的第四方面，提供了一种用于基因敲除的试剂盒，包括上述sgRNA、BE3以及扩增试剂。本专利技术利用CRISPR/Cas9基础上发展的碱基编辑技术，通过精准的CT或GA单碱基突变创造终止密码子，并结合多条sgRNA共注射提高基因敲除效率，从而建立了一种高效、精确以及低脱靶效应的基因敲除策略。附图说明图1为根据本专利技术利用CT突变实现目标基因被敲除的示意图(粗体下划表示PAM；斜体表示突变编码子；斜体加粗下划表示突变碱基)；图2为BE3的结构示意图；图3为在小鼠胚胎上基因敲除效率的示意图；图4为在小鼠上基因敲除效率的示意图。具体实施方式首先，进行sgRNA的设计。碱基定点编辑是利用sgRNA将BE3定位到靶位点，靶基因特异性sgRNA的选择和设计是本专利技术的关键之处。本专利技术如下选择设计sgRNA：选定待敲除基因的编码区的19～21bp–NGG目标序列，使其包含完整的目标密码子CAA、CAG或CGA，其中目标单碱基C位于目标序列的第4-8位，目标密码子与NGG间隔12-14bp；利用sgRNA序列来将BE3定位到目标序列以使目标密码子中的目标单碱基C变成T从而相应引入终止密码子TAA或TAG、TGA；在替代方案中，则选定待敲除基因的编码区的CCN-19～21bp目标序列，使其包含完整的目标密码子TGG，目标单碱基G优选位于目标序列的(右端)第4-8位，目标密码子优选与CCN间隔间隔12-14bp。针对两个靶基因——小鼠Pcdc1和Tyr，本专利技术选定下述目标基因序列来设计相应的sgRNA(粗体下划表示PAM；斜体下划表示候选突变编码子)：1.Pcdc1Sg-1:aaaacaggccgccttctgtaatgg(SEQIDNO.1)Sg-2:cggtttcaaggcatggtcattgg(SEQIDNO.2)Sg-3:cctggtcattcacttaagctgtg(SEQIDNO.3)2.TyrSg-1:tgcggccagctttcaggcagagg(SEQIDNO.4)Sg-2:ccttcttctcctcctggcaggta(SEQIDNO.5)Sg-3:ccagggtttctgccttggcacag(SEQIDNO.6)针对上述选定的目标基因序列，鼠Pcdc1(3条)、Tyr(3条)，构建相应的sgRNA表达载体，将不同的sgRNA分别导入pGL3-U6-EGFP-sgRNA。实施例1在细胞系上进行BE3介导的碱基编辑，引入终止密码子，实现基因敲除。按常规操作，进行细胞株的基因敲除(通过电转或脂质体转染)，以脂质体转染为例。(1)以N2a细胞为例，本专利技术进行真核生物细胞的培养与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小鼠Tyr基因敲除方法，包括：/n选定待敲除基因的编码区的至少两个19～21bp-NGG目标序列，使其分别包含完整的目标密码子CAA、CAG或CGA，其中的目标单碱基C位于目标序列的第4-8位，目标密码子与NGG间隔12-14bp；/n利用至少两个sgRNA序列来将BE3定位到相应的目标序列以使目标密码子中的目标单碱基C变成T从而相应引入终止密码子TAA或TAG、TGA以实现基因敲除；/n所述至少两个sgRNA序列为分别与所述至少两个目标序列互补对应的19～21bp序列，/n其中所述至少两个sgRNA被共注射以实现同一基因的有效敲除。/n

【技术特征摘要】
1.一种小鼠Tyr基因敲除方法，包括：
选定待敲除基因的编码区的至少两个19～21bp-NGG目标序列，使其分别包含完整的目标密码子CAA、CAG或CGA，其中的目标单碱基C位于目标序列的第4-8位，目标密码子与NGG间隔12-14bp；
利用至少两个sgRNA序列来将BE3定位到相应的目标序列以使目标密码子中的目标单碱基C变成T从而相应引入终止密码子TAA或TAG、TGA以实现基因敲除；
所述至少两个sgRNA序列为分别与所述至少两个目标序列互补对应的19～21...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄行许，王新，贾堃，
申请(专利权)人：肇庆华夏凯奇生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44