一种核酸酶的基因序列及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种核酸酶的基因序列，该序列为SEQ ID NO.1。本发明专利技术还提供了一种标签修饰的信号肽，该序列为SEQ ID NO.2，基因序列为SEQ ID NO.3。在SEQ ID NO.1的N端添加SEQ ID NO.3并构建重组载体，该重组载体转化X33酵母得到高表达的核酸酶。该方法提高了全能核酸酶的产量，简化了纯化工艺，降低了生产成本，对核酸内切酶消化宿主细胞核酸残留提供了技术支持。持。持。

【技术实现步骤摘要】
一种核酸酶的基因序列及应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种全能核酸酶分子的制备方法。

技术介绍

[0002]核酸残留是生物样本制备中常遇到的问题。生物制品中的重组蛋白药、抗体药、疫苗等产品都是用连续传代的动物细胞株表达生产，虽然经过严格的纯化工艺，但产品中仍有可能残余宿主细胞的DNA片段，这会带来传染性或致癌性风险，如可能携带HIV病毒或Ras癌基因的残留核酸片段。同时，分布在哺乳动物细胞基因组的LINE
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1序列可能发挥逆转录转座子作用，从而导致癌基因的激活/抑制。此外，由于微生物来源的基因组DNA富含CpG和非甲基化序列，也增加了重组蛋白药物在体内的免疫源性风险
[1
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3]。
[0003]在核酸残留去除工作中，难点是由于DNA带有大量的电荷易与其他生物大分子结合从而产生聚集(吸附)、包裹作用而难以完全除去。传统的方法均存在低含量核酸残留去除不净、工作量大耗时长的缺陷。
[0004]广谱核酸内切酶是一种非特异性核酸内切酶。来源于一种致病菌灵杆菌又称粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，因此只能采用基因工程生产。该酶可降解双链、单链、线状、环状的DNA和RNA，完全将核酸降解成3
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5个碱基长度的5'
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单磷酸寡核苷酸。因其能高效降解任何形式的DNA和RNA，又被称为“全能核酸酶”。全能核酸酶切效率远高于其他核酸酶，其活性是牛胰DNase I的34倍，葡萄糖球菌核酸酶的6倍。/>[0005]广谱核酸内切酶在国外被广泛用于新型疫苗和蛋白药物研发和生产，用于下游纯化工艺中去除核酸残留。但商品化的核酸内切酶国内外均是采用大肠杆菌生产，其缺点是产量低，纯化方法复杂，内毒素去除不易，因此价格很高。毕赤酵母作为一个真核单细胞生物，自开发用于重组蛋白表达以来，被广泛用于高密度发酵生产胞外分泌蛋白，有些蛋白产量能达到10g/L。只要找到合适的信号肽，灵杆菌核酸酶将能在毕赤酵母中大量表达并分泌到细胞外而不会对宿主细胞本身产生毒害。
[0006]信号肽大多位于初生蛋白N端，也有少量存在于蛋白内部或者C端，长度从15个氨基酸到50个氨基酸不等。信号肽是蛋白胞外分泌表达必不可少的元件，现已有许多研究结果表明，适当改造信号肽能显著提高外源蛋白的分泌表达效率。研究表明，多种外源基因连接上信号肽后，在原核表达系统，如大肠杆菌、L型细菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌中等都得到了分泌表达；信号肽也广泛应用于真核表达系统如毕赤酵母和昆虫杆状病毒表达系统中。
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‑
195.

技术实现思路

[0010]为了解决上述问题，本专利技术提供了一种核酸酶的基因序列，该序列为SEQ ID NO.1。本专利技术还提供了一种标签修饰的信号肽，该序列为SEQ ID NO.2，基因序列为SEQ ID NO.3。在SEQ ID NO.1的N端添加SEQ ID NO.3并构建重组载体，该重组载体转化X33酵母得到高表达的核酸酶。
[0011]一方面本专利技术提供了一种核酸酶的基因序列，该序列为SEQ ID NO.1或与该序列具有90％以上同一性的序列。
[0012]具体地，根据GeneBank获得全能核酸酶smNuc基因序列(M19495.1)，去掉其信号肽序列，用软件优化其编码密码子获得SEQ ID NO.1。
[0013]另一方面，本专利技术提供了一种标签修饰的信号肽，该序列为SEQ ID NO.2。
[0014]具体地，所述的标签为His标签。
[0015]又一方面，本专利技术提供了编码前述的信号肽的基因序列。
[0016]具体地，该基因序列为SEQ ID NO.3或与该序列具有90％以上同一性的序列。
[0017]所述的具有90％以上同一性的序列指由于一个氨基酸由一个以上的三联体密码编码即密码子的简并性，导致不同的基因序列编码同一种氨基酸的现象。认为与基因SEQ ID NO.3具有90％以上同一性的序列是可以编码同一种氨基酸的。
[0018]又一方面，本专利技术提供了一种包括核酸酶基因序列的重组载体。
[0019]具体地，该重组载体还包括信号肽的基因序列。
[0020]所述的载体可以是：质粒、噬菌体、病毒；优选为质粒；进一步优选为pPICZA质粒。
[0021]所述的载体的构建方法为：将pPICZA质粒酶切、纯化，与核酸酶基因连接。
[0022]又一方面，本专利技术提供了包括核酸酶基因序列的重组载体的制备方法。
[0023]具体地，所述的制备方法中包括：
[0024]在核酸酶的基因序列的N端添加信号肽的基因序列获得SEQ ID NO.4；
[0025]对SEQ ID NO.4进行PCR扩增得到PCR产物；
[0026]PCR产物与质粒构建载体，并将该载体转化到大肠杆菌；
[0027]筛选阳性质粒，并测序确认。
[0028]进一步具体地，所述的重组载体的构建方法为：质粒载体进行酶切并纯化；将质粒载体的酶切片段与前述的总基因序列连接。
[0029]优选地，所述的质粒载体为pPICZA质粒载体。
[0030]所述的转化的操作为：取大肠杆菌感受态细胞加入适量前述的重组载体，通过冰浴、热激、冰浴后于培养液中培养。
[0031]优选地，所述的重组载体的加入量为：体积不超过5μL。
[0032]所述的阳性质粒的筛选方法为：取前述的培养液涂在含有抗生素的固体培养基上过夜培养获得阳性质粒。
[0033]优选地，所述的抗生素为博来霉素。
[0034]又一方面，本专利技术提供了一种重组载体的细胞。
[0035]所述的细胞可以是用于表达蛋白的基因工程细胞，包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸酶的基因序列，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1具有90％以上同一性的序列。2.一种标签修饰的信号肽，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.2。3.编码权利要求2所述的信号肽的基因序列。4.根据权利要求3所述的基因序列，其特征在于，该基因序列为SEQ ID NO.3或与SEQ ID NO.3具有90％以上同一性的序列。5.一种包括权利要求1所述的核酸酶的基因序列的重组载体。6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，还包括权利要求4所述的信号肽的基因序列。7.一种重组载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在权利要求1所述的核酸酶的基因序列的N端添加权利要求4所述信号肽的基因序列获得SEQ ID NO.4；(2)对步骤(1)中的SEQ ID NO.4进行PCR扩增得到PCR产物；(3)PCR产物与...

【专利技术属性】
技术研发人员：章文羿，方华明，王双燕，汤创，赵长有，李小芳，
申请(专利权)人：北京安必奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：