用于人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种用于人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增检测的试剂盒。本发明专利技术所述试剂盒的组份设置及其结果判读方案使得检测过程简便，可操作性强。检测结果可靠、特异性好，同时利用实时荧光PCR技术，通过计算ΔCt值对乳腺癌组织标本中的HER2基因扩增水平进行检测，可用于通过血液ctDNA检测进行乳腺癌辅助诊断，临床以及预后等多个研究领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体设及一种人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增的检测试剂盒。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。在欧美国家，乳腺癌占女性恶性肿瘤的25％-30％。20世纪末的统计资料表明全世界每年约有130万人诊断为乳腺癌，而有40万人死于该病。在我国许多大城市，乳腺癌发病率已经上升为女性恶性肿瘤的第一或第二位，死亡率占第四位或第五位，成为妇女健康的最大威胁。表皮生长因子受体-2(Epidermalgrowthfactorreceptor-2,HER2),是一种位于乳腺和乳腺癌细胞表面的受体，能够控制癌细胞的生长、浸润和癌细胞的转移，大约20％的乳腺癌病例中存在HER2基因和/或蛋白水平增加，它是乳腺癌的独立预后因子，在乳腺癌的靶向治疗和预后判断中的作用已经得到了全世界临床医生的认可。HER2阳性的肿瘤是一种高危肿瘤，HER2癌基因的扩增预示病情进展迅速，局部复发的危险性高，化疗缓解期短，无病生存期(DFS)和总生存期(OS)缩短，对某些常规的化疗和激素治疗反应性差。目前最为常用并经FDA批准的适用于治疗HER2过度表达或HER2基因扩增的乳腺癌的药物是曲妥珠单抗(赫赛汀)，由于这种药物只有针对HER2基因扩增和蛋白过度表达的病人才有效，因此准确评价HER2基因和蛋白水平至关重要。鉴于HER2基因在乳腺癌诊断和治疗上的指导意义，采用灵敏、有效的方法对它进行检测显得极其重要。目前，检测HER2的方法主要有ELISA、IHC、FISH、CISH、RT-PCR等，其中临床最常用的是IHC法和FISH法，而IHC法是检测HER2的蛋白表达水平，FISH法是检测HER2的基因扩增水平。国内大部分医院已经开展了HER2IHC检测,该方法简便易行、价格低廉、但易受多种因素的影响。国外探针试剂盒及靶向药物(赫赛汀)较昂贵，FISH技术要求较高，而国内各医疗单位乳腺癌HER2检测的准确性、可重复性和完整性尚不尽人意。外周血循环肿瘤核酸中可检测到与乳腺癌细胞一致的基因突变。这些基因突变的检测可以为乳腺癌的分期及药物的治疗和预后提供丰富的信息。因此，外周血循环肿瘤DNA的Her2基因扩增检测为乳腺癌的早期诊断和治疗提供的很好的研究方向。
技术实现思路
鉴于上述问题，提出了本专利技术，以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的用于外周血循环肿瘤核酸DNA中Her2基因扩增的检测试剂盒。在第一方面，本专利技术提供了一种人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增检测的试剂盒，所述试剂盒包括：靶向Her2基因目的位点的特异引物、Her2基因特异性水解探针、内参基因的引物和内参基因的水解探针。在本专利技术的一些实施方案中，所述Her2基因目的位点为Her2基因共济失调毛细血管扩张突变ATM区。在本专利技术的一些实施方案中，所述内参基因为GAPDH、β-actin、B2M、SDHA、HPRT1中的一种或者多种。在本专利技术的一些实施方案中，所述Her2基因目的位点的特异引物分别为：正向引物：5’-ggctccagagcccacaggc-3’SEQIDNO:1；反向引物：5’-tttgttgagccaaacaaagttctctgt-3’SEQIDNO:2。在本专利技术的一些实施方案中，所述Her2基因特异性水解探针为5’-ccctcactgatcttgccttccttgctctccacccctgacc-3’SEQIDNO:3。在本专利技术的一些实施方案中，所述内参基因的引物选自以下引物对：5’-ttggatttggatatttttattgtaaaa-3’SEQIDNO:4和5’-aattcggcaaaacacccaaacaccca-3’SEQIDNO:5；5’-taatttgtgtgtgtgtttattggtttg-3’SEQIDNO:6和5’-cctccacccaattcaaagaacaccaa-3’SEQIDNO:7；5’-tttatattattataatggaaagtatg-3’SEQIDNO:8和5’-atttcaataagtaaaaaacaaaaaaac-3’SEQIDNO:9；5’-gtggttagagttaatattatatagtatg-3’SEQIDNO:10和5’-aaatatactattaacaataaccaccat-3’SEQIDNO:11；以及5’-gattatagataggggtgagagaaaga-3’SEQIDNO:12和5’-cttatagataggggtgagagaaaga-3’SEQIDNO:13。在本专利技术的一些实施方案中，所述内参基因的水解探针选自5’-ctaacctttaaaatcaaat-3’SEQIDNO14、5’-aaatacacacaaacgttca-3’SEQIDNO:15、5’-aacatttactagaaataat-3'SEQIDNO:16、5’-taatattacacataaccac-3’SEQIDNO:17、5,-accacaaataatacacatcc-3'SEQIDNO:18中的任一个。在本专利技术的一些实施方案中，所述Her2基因的探针和内参基因的探针5'端报告荧光基团分别选自FAM、TET、HEX、TAMRA、TexasRed、Rox和Cy5中的一种。在本专利技术的一些实施方案中，所述Her2基因的探针和内参基因的探针3'端的淬灭基团分别选自BHQ1、BHQ2、TAMRA和DABCYL中的一种。在本专利技术的一些实施方案中，所述试剂盒中还包含阴性质控品、阳性质控品和无模板对照。在本专利技术的一些实施方案中，所述阳性质控品为乳腺癌Her2阳性基因组DNA、所述阴性质控品为健康人全基因组DNA。在本专利技术的一些实施方案中，所述试剂盒中，PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10XPCR缓冲液、0.1～ImMdNTPs、0.01～0.lOU/ulTaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁。在第二方面，本专利技术提供如第一方面所述的试剂盒在制备用于扩增人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因的药物中的用途。有益效果：1、本专利技术通过Her2基因与内参基因PCR扩增结果的计算，来对检测结果给出判定，提高了检测结果的敏感性和可靠性。Her2基因与内参基因PCR扩增结果指其Ct值，即Her2基因与内参基因的巧光信号到达设定的阔值时所经历的循环数。通过Her2基因与内参基因PCR扩增结果的计算来对检测结果给出判定的方式是：Her2基因Ct《32,判定结果：阳性；Her2基因Ct>32,Her2基因Ct-内参基因Ct《8,判定结果：阳性；Ct>32，Her2基因Ct-内参基因Ct>8,判定结果：阴性。2、本专利技术利用循环肿瘤DN的Her2基因模板非特异性扩增，提高了其灵敏度，可W在循环肿瘤DNA中检测Her2基因状况，操作简单。通过目的基因与内参基因PCR扩增结果的计算，来对检测结果给出判定，提高了检测结果的敏感性和可靠性。3、本申请与直接测序法的不同之处在于此申请所用方法为直接通过PCR(聚合酶链式反应)得到的巧光信号直接判断Her2基因状态；而直接测序法需要通过PCR对目标区域扩增后进行测序反应方能得到Her2基因的状态。4、本专利技术所本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增检测的试剂盒，所述试剂盒包括：靶向Her2基因目的位点的特异引物、Her2基因特异性水解探针、内参基因的引物和内参基因的水解探针。

【技术特征摘要】
1.一种人外周血循环肿瘤DNA中Her2基因扩增检测的试剂盒，所述试剂盒包括：靶向Her2基因目的位点的特异引物、Her2基因特异性水解探针、内参基因的引物和内参基因的水解探针。2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述Her2基因目的位点为Her2基因共济失调毛细血管扩张突变ATM区。3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述内参基因为GAPDH、β-actin、B2M、SDHA、HPRT1中的一种或者多种。4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述Her2基因目的位点的特异引物分别为：正向引物：SEQIDNO:1；反向引物：SEQIDNO:2。5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述Her2基因特异性水解探针为SEQIDNO:3。6.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述内参基因的引物选自以下引物对：SEQIDNO:4和5、SEQIDNO:6和7、SEQIDNO:8和9、SEQIDNO:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：章文羿，李晶，崔航，黄清瑞，
申请(专利权)人：北京安必奇生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11