纤维素酶及其编码基因、重组载体和应用制造技术

本发明专利技术提供一种新的纤维素酶，所述纤维素酶的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：1-3中任一项所述的氨基酸序列95％以上的同源性。本发明专利技术还涉及编码所述纤维素酶的核苷酸序列。所述核苷酸序列与SEQ ID NO：4-6中任一项所示核苷酸序列的同源性70％以上。本发明专利技术还涉及一种含有所述核苷酸序列的重组载体，以及利用所述重组载体转化、转导或转染得到的遗传工程化宿主细胞。本发明专利技术提供的纤维素酶耐酸性pH和高温，因此，在恶劣的工业催化条件下有潜在的用途。

Cellulase and its coding gene, recombinant vector and Application

The present invention provides a new cellulase with amino acid sequence homology above 95% SEQ ID NO:1-3 in any of the amino acid sequence of the cellulase. The present invention also relates to nucleotide sequences encoding the cellulase. The nucleotide sequence of ID NO:4-6 and SEQ shown in any one nucleotide sequence homology of more than 70%. The invention also relates to a recombinant vector comprising the nucleotide sequence, and a genetically engineered host cell obtained by transformation, transduction, or transfection with the recombinant vector. The cellulase provided by the present invention has acid resistance, pH and high temperature, and therefore has potential use in harsh industrial catalysis conditions.

【技术实现步骤摘要】
纤维素酶及其编码基因、重组载体和应用
本专利技术属于生物工程领域，涉及一种新的纤维素酶，及其制备方法和应用。本专利技术还涉及所述纤维素酶的编码基因、重组载体以及其重组基因工程菌株。
技术介绍
纤维素是植物细胞壁的主要结构组分，也是自然界中含量最丰富的有机聚合物，纤维素为生产生物燃料产品提供了巨大的应用潜力。纤维素酶是能够降解纤维素，将纤维素水解并转化为葡萄糖的一类酶系的总称。最早的纤维素酶是1906年Seilliere从蜗牛消化液中发现的，随后又从其它动物、植物以及微生物体内发现。80年代以来，由于分子生物学的发展及生物工程技术的兴起，纤维素酶的研究得以快速发展。许多微生物可以分泌纤维素酶，它们能够在独立的酶或多蛋白复合物中被激活。但是由于培养技术的限制，自然界中大部分微生物未能获得纯培养，当前科学家在实验室条件下能够培育的微生物，少于在自然界中可观察到的所有微生物的1％，因此可以从培养微生物中筛选出的纤维素酶种类单一、重复率高，在一定程度上阻碍了人们对纤维素酶的认识和应用。虽然纤维素酶被广泛研究，并且已经从不同的宿主中鉴别出多于一千种纤维素酶。但是当前对具有可以用于工业应用的不同性质的新纤维素酶仍然存在需求，例如对不溶的纤维素底物具有更高的催化效率的纤维素酶，在升高的温度和特异性pH值下稳定性增加的纤维素酶，或者对盐或有机溶剂具有更高的耐受性的纤维素酶等。同时，当使用纤维素酶将预处理的含纤维素的材料水解为糖，使其可以大规模发酵以生产商品例如乙醇或其它生物制品时，可以预期的是纤维素酶市场将急剧扩张。但是，许多纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖的效率低，使得从木质纤维素生物质生产燃料乙醇的花费较高。宏基因组方法涉及从环境样品中直接提取DNA，并且进一步使用两种主要的方法分析。首先，在合适的克隆载体和宿主中，使用DNA构建宏基因组文库，通过基于功能或基于序列的方法分离新的生物催化剂。其次，使用新近的测序技术，例如Illumina，宏基因组测序成为发现新的生物催化剂的最有利的工具。宏基因组方法可以用于从各种环境样品中分离纤维素酶，例如植物材料、土壤、高等白蚁的后肠内容物、堆肥、兔盲肠的内容物、沼气反应池中的淤泥，和富集培养物等。来自特定环境的纤维素酶基因显示了某些特性。因此，可以从未培养的微生物中鉴别新的纤维素酶，并获得纤维素酶基因。例如从土壤样品中得到的耐盐纤维素酶Cel5A，或从水牛瘤胃中得到的内切葡聚糖酶C67-1等。耐盐纤维素Cel5A是第一个被详细描述的源于宏基因组的纤维素酶，它是从土壤样品中分离的(Vogetetal.2006)。该纤维素酶在广泛的pH范围(pH5.5-9)显示了高水平的稳定性，稳定在40"C直至11h，同时还显示出高耐盐性，在3MNaC1中具有活性并稳定。从水牛瘤胃中分离的内切葡聚糖酶C67-1是酸性酶，但是在酸性(pH≥3.5)和碱性(pH达到10.5)条件下都非常稳定(Duanetal.2009)。Pottkamper等人(2009)鉴别出了三种新的源于宏基因组的纤维素酶，其适合存在于高浓度的不同离子溶液的纤维素降解。但是，现有技术中并没有报道在酸性条件下以及高热环境中保持稳定的纤维素酶，而对于恶劣的工业催化条件，例如在生物燃料生产、废水处理、纺织和制浆等领域中，对这样的酶存在需求。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供一种新的纤维素酶、其编码基因、重组载体，以及遗传工程化的宿主细胞。本专利技术提供的纤维素酶是通过宏基因组技术，从啤酒糟宏基因组中得到的，该酶的酶活力在酸性条件下是稳定的，并且具有更强的耐热性，因此可以用于恶劣的工业催化条件，例如生物燃料生产、废水处理、纺织和制浆等领域。一方面，本专利技术提供了一种具有纤维素酶生物学功能或活性的肽或蛋白，所述肽或蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO：1-3中任一项所示的氨基酸序列的同源性为95％以上。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQIDNO：1-3中任一项所示的氨基酸序列的肽或蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽或蛋白的片段、或肽或蛋白的变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本专利技术的保护范围之列。具体的变体可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本专利技术所述的肽或蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持与本专利技术所述的纤维素酶相同的生物学功能或活性的肽或蛋白，可以是下列情形：(I)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(II)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(III)成熟肽或蛋白与另一种化合物(比如延长肽或蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融合到成熟的肽或蛋白而形成的肽或蛋白序列(如用来纯化此肽蛋白的序列或蛋白原序列)。所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方法所用的宿主，本专利技术的肽或蛋白可以是糖基化的。本专利技术的肽或蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。优选的，所述肽或蛋白的氨基酸序列选自SEQIDNO：1-3所示的氨基酸序列中的一项。本专利技术还涉及编码所述肽或蛋白的核苷酸序列。所述核苷酸序列与SEQIDNO：4-6中任一项所示的核苷酸序列的同源性为70％以上。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQIDNO：4-6中任一项所示的核苷酸序列的变体，只要其与该核苷酸序列具有70％以上同源性，均属于本专利技术保护范围之列。所述核苷酸序列的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的核苷酸序列。此核苷酸序列的变体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是核苷酸序列的替换形式，它可能是核苷酸序列的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽或蛋白的功能。另外，可与SEQIDNO：4-6中任一项所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本专利技术保护范围之列，特别是在严格条件下可与本专利技术所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的肽或蛋白与SEQIDNO：1-3中任一项所示的肽或蛋白有相同的生物学功能和活性。优选地，所述核苷酸序列选自SEQIDNO：4-6所示的核苷酸序列中任一种。本专利技术的专利技术人将具有纤维素酶活性或功能的肽或蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列经蛋白质数据库和核苷酸数据库分别进行搜寻比较，未发现有任何相同氨基酸序列和核苷酸序列，因此其为新型纤维素酶，属于糖苷水解酶家族5，分别命名为cel7482、cel3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有纤维素酶生物学功能或活性的肽或蛋白，所述肽或蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：1‑3中任一项所示氨基酸序列的同源性为95％以上。

【技术特征摘要】
1.一种具有纤维素酶生物学功能或活性的肽或蛋白，所述肽或蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO：1-3中任一项所示氨基酸序列的同源性为95％以上。2.根据权利要求1所述的肽或蛋白，其中，所述肽或蛋白的氨基酸序列选自SEQIDNO：1-3中的任一项。3.编码如权利要求1或2所述的肽或蛋白的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列与SEQIDNO：4-6中任一项所示核苷酸序列的同源性为70％以上；优选地，所述核苷酸序列选自SEQIDNO：4-6中任一项。5.一种含有如权利要求3或4所述核苷酸序列的重组载体。6.一种遗传工程化宿主细胞，其使用如权利要求5所述的重组载体转化、转导或转染得...

【专利技术属性】
技术研发人员：张彤，杨超，夏雨，李桉栋，王玉波，李炳，毛艳萍，
申请(专利权)人：香港大学，
类型：发明
国别省市：中国香港,81