一种改造的木质纤维素酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种改造的木质纤维素酶及其应用，在碳水化合物结合区进行如下改造：碳水化合物结合区第14位的丝氨酸替换为天冬氨酸；或者，碳水化合物结合区第21位的丝氨酸替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第24位的苏氨酸替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第14位的丝氨酸以及第21位的丝氨酸同时替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第14位的丝氨酸、第21位的丝氨酸以及第24位的苏氨酸同时替换为天冬氨酸；本发明专利技术所述改造的碳水化合物结合区使得与包含亲本碳水化合物结合区的亲本纤维素酶相比，水解活性提高，亲本碳水化合物结合区可操作地通过连接区与所述纤维素酶中存在的相同的纤维素酶催化结构域相连。

【技术实现步骤摘要】
一种改造的木质纤维素酶及其应用
本专利技术涉及一种改造的木质纤维素酶及其应用，特别涉及包含编码所述改造纤维素酶的核酸序列的基因构建体，从宿主菌株中生产所述改造纤维素酶的方法和用所述改造的纤维素酶在木质素存在的条件下对纤维素水解的方法，属于基因工程

技术介绍
纤维素是陆地上最主要的光和作用产物，因其具有储藏量大、生产周期短、绿色无污染等特点，降解纤维素获得生物燃料替换日益枯竭的化石原料备受人们的青睐。木质纤维素的降解分为酸降解和纤维素酶降解：自二战至今，酸降解法被证明糖得率低，成本高，设备投资大；而纤维素酶降解法由于潜在成本低，环境友好，糖得率高，被研究者广泛关注。木质纤维素干重的90％是以纤维素、半纤维素、木质素以及果胶的形式存在的(Jensen,etal.,2008；etal.,2013)。结构复杂，纤维素、半纤维素和木质素交联存在以及木质纤维素的不溶性是阻碍木质纤维素通过生物转化的方法获得燃料乙醇的主要因素(Yanetal.,2015)。因此，提高纤维素酶对纤维素的可及性或者降低纤维素酶对木质素的非特异性吸附是提高木质纤维素降解效率、降低纤维素酶用量，进而降低燃料乙醇生产成本可行的方法。为了降低木质素的抑制作用，往往通过蒸汽爆破、氨处理、酸处理或者有机溶剂处理木质纤维素等方法降低木质素含量或者使得纤维素表面暴露以提高木质纤维素的水解效率。这些物理或者化学处理方法能够很好的提高木质素纤维的降解效率，然而由于木质纤维素结构复杂，往往很难将木质素清除干净，预处理后残留的木质素仍然对木质纤维素的降解产生一定影响。纤维素酶属于糖苷水解酶，糖苷水解酶往往采取不同模块的组合形式来提高对这些大物质分子的降解能力。一般来说，糖苷水解酶包含一个催化结构域、一个或者几个串联的碳水化合物结合区以及将二者相连的连接区。碳水化合物结合区是独立存在于酶蛋白的区域，他们能够使其所在的蛋白质接近、结合并富集于作用的底物，对促进碳水化合物降解酶的降解活性具有重要作用。真菌纤维素酶的碳水化合物结合区氨基酸序列相似度非常高，有些位点的氨基酸高度保守，例如形成平滑面的三个芳香族氨基酸、29位的天冬酰胺及34位的谷氨酰胺等(Linderetal.,1995)。碳水化合物结合区中的芳香类氨基酸(酪氨酸和色氨酸)形成光滑的疏水面与碳水化合物中的吡喃糖环结构通过疏水作用相互结合(Simpsonetal.,2000)。研究表明，除了三个芳香族氨基酸外，极性氨基酸，例如Q7、N29和Q34等同样参与了疏水面的形成(Fukudaetal.,2006；Beckhametal.,2010)。同时，极性氨基酸产生的氢键作用同样在结合中发挥作用(HildenandJohansson,2004)，并且这些极性氨基酸位点的突变可能会影响疏水面的形成，降低纤维素酶与纤维素的结合活性，从而降低了纤维素酶活性。Strobel(2015)等利用研究表明，当碳水化合物结合区平滑面中的芳香族氨基酸或者极性氨基酸突变为丙氨酸后，里氏木霉CBHI对纤维素和木质素的亲和力同时降低；同时他们指出，除个别氨基酸外，碳水化合物结合区点突变对纤维素及木质素的吸附能力变化高度的一致。然而，碳水化合物结合区除了能够识别、吸附纤维素链之外，还能够与木质素非特异性的吸附，并且木质素与碳水化合物结合区的吸附性非常强。因此如何降低纤维素酶与木质素的非特性吸附对提高纤维素酶降解活性、降低燃料乙醇生产成本具有重要意义。通常来说，木质素表面携带有大量的负电荷。Lan(2013)等的研究表明，pH对纤维素酶水解木质纤维素产生影响，较高的pH(5.2-6.2)条件下木质纤维素的水解效率高于pH在4.8或者5.0时。高pH时的水解效率，木质素表面携带的负电荷增加，同时亲水性提高，这降低了纤维素酶与木质素的非特异性的吸附作用。提高反应体系的pH值时，由于纤维素酶的pI较低，其表面所携带的负电荷增加，因此纤维素酶与木质素之间的电荷相斥作用增强，同样使得纤维素酶与木质素非特异性吸附降低(Louetal.,2013)。同时有报道表明(Strobeletal.,2016)，增加碳水化合物结合区区负电荷突变时，碳水化合物结合区对木质素的吸附降低。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种改造的木质纤维素酶及其应用。本专利技术的技术方案如下：一种改造的木质纤维素酶，在碳水化合物结合区进行如下改造：碳水化合物结合区第14位的丝氨酸替换为天冬氨酸；或者，碳水化合物结合区第21位的丝氨酸替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第24位的苏氨酸替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第14位的丝氨酸以及第21位的丝氨酸同时替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第14位的丝氨酸、第21位的丝氨酸以及第24位的苏氨酸同时替换为天冬氨酸；所述的碳水化合物结合区属于糖水化合物结合区第一家族，与来自木霉属(Trichodermasp.)、曲霉属(Aspergillussp.)、青霉属(Penicilliumsp.)、肉座菌属(Hypocreasp.)、腐质霉属(Humicolasp.)、支顶孢属(Acremoniumsp.)、裸节菌属(Talaromycessp.)或者脉孢菌属(Neurosporasp.)的Cel5A、Cel6A、Cel7A、Cel7B纤维素酶、碳水化合物酯酶或者木聚糖酶的碳水化合物结合区具有高于70％的同源性。根据本专利技术优选的，所述碳水化合物结合区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述碳水化合物结合区的表达基因核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。根据本专利技术优选的，所述碳水化合物结合区第14位的丝氨酸替换为天冬氨酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。进一步优选的，所述改造的木质纤维素酶氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。根据本专利技术优选的，所述碳水化合物结合区第21位的丝氨酸替换为天冬氨酸，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。进一步优选的，所述改造的木质纤维素酶氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。根据本专利技术优选的，所述碳水化合物结合区第24位的苏氨酸替换为天冬氨酸，氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。进一步优选的，所述改造的木质纤维素酶氨基酸序列如SEQIDNO.10。根据本专利技术优选的，所述碳水化合物结合区第14位的丝氨酸以及第21位的丝氨酸同时替换为天冬氨酸，氨基酸序列如SEQIDNO.5所示。进一步优选的，所述改造的木质纤维素酶氨基酸序列如SEQIDNO.11所示。根据本专利技术优选的，所述碳水化合物结合区第14位的丝氨酸、第21位的丝氨酸以及第24位的苏氨酸同时替换为天冬氨酸，氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。进一步优选的，所述改造的木质纤维素酶氨基酸序列如12所示。上述改造的木质纤维素酶在木质素存在的条件下水解纤维素的应用。改造原理本专利技术所述改造后的碳水化合物结合区能够使得木质素对纤维素酶的抑制作用降低，从而增加了在木质素存在条件下的纤维素水解活性。具体地，本专利技术涉及包含碳水化合物结合区的纤维素酶，所述改造碳水化合物结合区能够与催化结构域通过连接区进行可操作地连接，所述改造的碳水化合物结合区的长度约为40个氨基酸，包含一个或多个氨基酸的替换。所述氨基酸的替换导致相对于衍生出所述改造碳水化合物结合区的亲本碳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改造的木质纤维素酶，其特征在于，在碳水化合物结合区进行如下改造：碳水化合物结合区第14位的丝氨酸替换为天冬氨酸；或者，碳水化合物结合区第21位的丝氨酸替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第24位的苏氨酸替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第14位的丝氨酸以及第21位的丝氨酸同时替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第14位的丝氨酸、第21位的丝氨酸以及第24位的苏氨酸同时替换为天冬氨酸；所述的碳水化合物结合区属于糖水化合物结合区第一家族，与来自木霉属(Trichoderma sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、青霉属(Penicillium sp.)、肉座菌属(Hypocrea sp.)、腐质霉属(Humicola sp.)、支顶孢属(Acremonium sp.)、裸节菌属(Talaromyces sp.)或者脉孢菌属(Neurospora sp.)的Cel5A、Cel6A、Cel7A、Cel7B纤维素酶、碳水化合物酯酶或者木聚糖酶的碳水化合物结合区具有高于70％的同源性。

【技术特征摘要】
1.一种改造的木质纤维素酶，其特征在于，在碳水化合物结合区进行如下改造：碳水化合物结合区第14位的丝氨酸替换为天冬氨酸；或者，碳水化合物结合区第21位的丝氨酸替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第24位的苏氨酸替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第14位的丝氨酸以及第21位的丝氨酸同时替换为天冬氨酸；或者碳水化合物结合区第14位的丝氨酸、第21位的丝氨酸以及第24位的苏氨酸同时替换为天冬氨酸；所述的碳水化合物结合区属于糖水化合物结合区第一家族，与来自木霉属(Trichodermasp.)、曲霉属(Aspergillussp.)、青霉属(Penicilliumsp.)、肉座菌属(Hypocreasp.)、腐质霉属(Humicolasp.)、支顶孢属(Acremoniumsp.)、裸节菌属(Talaromycessp.)或者脉孢菌属(Neurosporasp.)的Cel5A、Cel6A、Cel7A、Cel7B纤维素酶、碳水化合物酯酶或者木聚糖酶的碳水化合物结合区具有高于70％的同源性。2.如权利要求1所述的木质纤维素酶，其特征在于，所述碳水化合物结合区的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1所述的木质纤维素酶，其特征在于，所述碳水化合物结合区第14位的丝氨酸替换为天冬氨酸，氨基酸序列如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：方诩，
申请(专利权)人：方诩，
类型：发明
国别省市：山东,37