本发明专利技术涉及基因工程领域。具体地，本发明专利技术涉及真菌来源的多结构域酸性纤维素酶及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供了一个新的纤维素酶基因，其编码的纤维素酶具有良好的性质，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。
Multi domain acidic cellulase derived from fungi and its gene and Application
The present invention relates to the field of genetic engineering. More specifically, the invention relates to a domain of acidic cellulase from fungi and gene and application thereof, its amino acid sequence is shown as SEQ ID or SEQ NO.1 ID NO.2. The present invention provides a new cellulase gene whose encoded cellulase has good properties and can be used in feed, food, medicine and other industries. According to the technical proposal of the invention, cellulase can be produced with genetic engineering means and has good properties and is suitable for industrial application.
【技术实现步骤摘要】
真菌来源的多结构域酸性纤维素酶及其基因和应用
本专利技术涉及基因工程领域。具体地，本专利技术涉及真菌来源的多结构域酸性纤维素酶及其基因和应用。
技术介绍
纤维素酶根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶。β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。真菌纤维素酶产量高、活性大，在畜牧业和饲料工作中主要应用真菌来源的纤维素酶。纤维素酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。纤维素酶的最主要来源是微生物，不同微生物合成的纤维素酶在组成上差异明显，对纤维素的降解能力也不尽相同。细菌与放线菌生产的纤维素酶产量均不高，在工业上很少应用，而真菌具有产酶的诸多优点。目前国内外，虽然许多纤维素酶被克隆分离及性质测定，但这些酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，pH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到新的能够满足实际应用需求的纤维素酶，从而能够进一步推广纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中应用。本专利技术从TalaromycesleycettanusJCM12802菌株中得到了一个新的多结构域纤维素酶基因，其编码的纤维素酶具有以下几个优点：酸性、耐高温、容易发酵生产。所有这些优点都意味着新专利技术的纤维素酶在饲料、食品、医药等行业中，将会比一千报道的纤维素酶更有应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种多结构域酸性纤维素酶。本专利技术的再一目的是提供上述纤维素酶的基因。本专利技术的再一目的是提供包含上述纤维素酶的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含上述纤维素酶基因的重组菌株。本专利技术的再一目的是提供一种制备纤维素酶的方法。本专利技术的再一目的是提供上述纤维素酶的应用。本专利技术首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的酸性纤维素酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1：其中，该酶全长654个氨基酸，N端18个氨基酸为信号肽序列“MQVLLVATLASFVGGAWA”。因此，成熟的纤维素酶Cel5的理论分子量为68.5kDa，其氨基酸序列如SEQIDNO.2：该纤维素酶的最适pH为3.0，在pH2.2-4.0范围内，该酶能够维持其50％以上的酶活力；最适温度为50℃，在30℃时依然具有约63％的酶活力，在50℃下处理60min，剩余酶活在60％以上，在60℃下处理10min，依然能够保持20％的酶活力。本专利技术还提供了编码上述纤维素酶的基因。该酶的全基因序列如SEQIDNO.3所示：本专利技术通过PCR的方法分离克隆了这个纤维素酶基因cel5X，DNA全序列分析结果表明，纤维素酶Cel5X结构基因全长2411bp，含有7个内含子，+77～152bp，+222～282bp,+637～688bp,+821～873bp，+1225～1285bp，+1308～1368bp，+2168～2249bp为其内含子序列，cDNA长1965bp，其cDNA序列如SEQIDNO.4所示：其中，信号肽的碱基序列为：“ATGCAAGTGTTGCTCGTCGCCACCCTCGCATCCTTCGTTGGAGGTGCCTGGGCG”因此，成熟基因的编码序列为SEQIDNO.5所示：成熟蛋白理论分子量为68.5kDa，该酶属于糖基水解酶第5家族。将纤维素酶基因cel5XcDNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对发现，确定cel5X是一种新的纤维素酶基因，与已经报道的来源于Penicilliumdecumbens的Cel5C相似度达到71％。Cel5X为多结构域纤维素酶，其N端包含一个家族CBM区，C端包含一个CBMX2。本专利技术还提供了包含上述纤维素酶基因的重组载体，优选为pPIC9-cel5X。将本专利技术的纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本专利技术的一个最优选的实施方案，优选为将纤维素酶基因插入到质粒pPIC9上的SnaBI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOXl启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-cel5X。本专利技术还提供了包含上述纤维素酶基因的重组菌株，优选为重组菌株GS115/cel5X。本专利技术还提供了一种制备纤维素酶的方法，包括以下步骤：1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组纤维素酶的表达；以及3)回收并纯化所表达的纤维素酶。其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)细胞、啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞或多型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichicpastoris)GS115，得到重组菌株GS115/cel5X。本专利技术还提供了上述纤维素酶的应用。运用基因工程手段来产业化生产纤维素酶。本专利技术提供了一个新的纤维素酶基，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本专利技术的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。附图说明图1为重组纤维素酶的SDS-PAGE电泳图。图2显示本专利技术的纤维素酶的酶学性质。具体实施方式试验材料和试剂1、菌株及载体：毕赤酵母(PichiapastorisGS115)为本实验室保存；毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基：(I)产酶培养基：30g/L麦麸，30g/L玉米芯粉，30g/L豆粕，5g/L大麦葡聚糖，5g/L(NH4)SO4，1g/LKH2PO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，0.01g/LFeSO4·7H2O，0.2g/LCaCl2于1L去离子水中，121℃，15磅条件下灭菌处理20min(2)大肠杆菌培养基LB(126蛋白胨、0.5％酵母提取物、126NaCI，pH7.O)。(3)BMGY培养基；1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.000049<Biotin，1％甘油(v/v)。(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1纤维素酶编码基因cel5X的克隆提取TalaromycesleycettanusJCM12802基因组DNA，以Talaromycesleycettanus总DNA为模板，以cel5X-F和cel5X-R为引物进行PCR扩增(见表1)，PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec,60℃30sec,72℃30sec,30个循环，得到一约1400bp片段，将该片段回收后送睿博生物技术有限公司测序。表1本实验所需的引物实施例2纤维素酶cDNA的获得提取Talaromycesleycetta本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纤维素酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种纤维素酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示。2.一种纤维素酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的纤维素酶。3.根据权利要求2所述的纤维素酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。4.包含权利要求2所述纤维素酶基因的重组表达载体。5.包含权利要求2所...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚斌，罗会颖，郑菲，涂涛，苏小运，黄火清，王苑，柏映国，王亚茹，孟昆，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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