一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶、基因、载体、工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶、基因、载体、工程菌及其在降解壳聚糖生产壳寡糖中的应用，所述双功能葡聚糖酶氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术的新型耐高温双功能葡聚糖酶的耐热性能良好，最适作用温度55℃，在pH 2.0‑6.5的条件下水解壳聚糖底物时的酶活稳定，能够高效水解100g/L的高浓度壳聚糖底物，8小时内彻底水解底物，产物为分子量在1500Da以下的低分子量壳寡糖，而且没有单糖副产物产生。酶活力能够达到1000U/ml，大大高于目前壳聚糖水解酶的普遍生产水平(10‑100U/ml)。

Bifunctional glucan having hydrolytic activity of chitosan, gene, vector, engineering bacterium and application thereof

The invention discloses a dual function chitosan hydrolysis activity of glucanase, gene, vector, engineering bacteria and the degradation of chitosan oligosaccharide production in the application of the dual function of glucanase amino acid sequence of SEQ ID NO.1 shown. Thermal properties of the novel high temperature resistant double evolutionthe function is good, the optimum temperature of 55 DEG C, in pH 2 6.5 hydrolysis of chitosan substrate enzyme activity can be stable, high concentration of chitosan substrate, the hydrolysis of 100g/L, within 8 hours of complete hydrolysis of substrate, low molecular weight chitosan oligosaccharide the product molecular weight below 1500Da, and no by-product of monosaccharide. The enzyme activity can reach 1000U/ml, much higher than the general level of production of chitosan hydrolase (10 100U/ml).

【技术实现步骤摘要】
一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶、基因、载体、工程菌及其应用(一)
本专利技术涉及一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶及其应用。(二)
技术介绍
葡聚糖酶(Glucanase，E.C3.2.1.73)可水解β-糖苷键而形成葡萄糖聚合物等小分子物质，属于纤维素酶类的一种。β-葡聚糖酶广泛应用于啤酒酿造、饲料等行业。壳聚糖(chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-β-D葡萄糖。壳聚糖是自然界唯一带正电荷的碱性聚糖，广泛用于医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域。壳聚糖被作为增稠剂、被膜剂列入国家食品添加剂使用标准GB-2760。壳寡糖是壳聚糖经过酶法或者化学裂解后得到的一种聚合度在2-20之间的寡糖产品，分子量≤3000Da，它具有壳聚糖所没有的较高溶解度，全溶于水，容易被生物体吸收利用。壳寡糖具有抗氧化，抗肿瘤，降血脂，降血压，抗菌抗炎等多种生物学活性，是一种极具开发潜力的食品，药品原料，也是一种绿色饲料添加剂，可部分替代抗生素，2014年被国家卫计委列为新食品原料。壳聚糖水解酶类主要来源于微生物，主要包括细菌(芽孢杆菌、黄杆菌)、真菌(曲霉、毛霉、木霉等)。其中某些具有壳聚糖水解活性的酶本身是葡聚糖酶，属于非专一性酶，不仅能够内切水解葡聚糖，而且能够有效水解壳聚糖生成壳寡糖。而常见的专一性壳聚糖酶往往只能水解壳聚糖。普通的壳聚糖酶没有被列入可用于食品和药品的酶制剂种类，而葡聚糖酶是可用于食品和饲料添加的安全酶制剂。具有壳聚糖酶活性的葡聚糖水解酶用于壳寡糖的生产，安全性更有保障，更符合国家的食品安全法规。壳聚糖酶解过程中需较长时间的高温反应(50-60℃，8小时)，因为高温可以促进底物的离子化，加速反应的进行；同时高浓度的壳聚糖底物具有较高的粘度，不利于实际生产操作，而高温能够有效降低底物粘度，加快反应速度，提升产物壳寡糖的纯度。常见壳聚糖酶耐热性能普遍较差(温度稳定范围35-45℃)，酶活力低(10-50U/ml)不能满足生产的需求。因此只有兼具耐高温性能好和高活性壳聚糖水解能力的酶，才能广泛地用于水解壳聚糖生产壳寡糖的生产中。(三)
技术实现思路
本专利技术提供了一种具有壳聚糖水解活性的新型耐高温双功能葡聚糖酶(即PRG酶)，该酶同时具有葡聚糖和壳聚糖水解活性，解决了现有壳聚糖生产中缺乏专一性、安全、耐高温且能够高效降解壳聚糖的水解酶的问题。PRG酶水解壳聚糖能力略高于葡聚糖底物的能力；PRG酶耐热性能良好，最适反应温度55℃，在70℃水浴环境中处理120min，残余酶活力还能够达到71％。PRG酶能够水解10％浓度的壳聚糖底物生产低分子量壳寡糖，平均分子量为1200。PRG酶在枯草芽孢杆菌表达系统中高效整合分泌表达，酶活力单位达到1000U/ml，具有重要的工业应用价值。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶，所述双功能葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示，酶蛋白由306个氨基酸组成，其理论分子量：33009.1Da。本专利技术还提供一种所述双功能葡聚糖酶的编码基因，所述编码基因核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术涉及一种由所述双功能葡聚糖酶编码基因构建的重组载体以及由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。本专利技术所述双功能葡聚糖酶基因(即PRG)的重组载体优选为pAX01-PRG。将本专利技术的新型双功能葡聚糖酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其受到强启动子木糖启动子调控，优选插入到质粒pAX01上的BamHI和SacII限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于木糖启动子的下游并受其调控，得到重组表达质粒pAX01-PRG。工程菌优选含双功能葡聚糖酶基因PRG的重组枯草芽孢杆菌BS168。此外，本专利技术还提供一种所述双功能葡聚糖酶在降解壳聚糖生产壳寡糖中的应用，具体所述的应用以含双功能葡聚糖酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的上清液提取的纯酶为催化剂，以壳聚糖为底物，以pH5.0、100mM醋酸-醋酸钠缓冲液为反应介质构成反应体系，55℃反应8小时，反应液经过陶瓷微滤膜(0.1微米孔径)过滤，然后滤液冷冻干燥，获得分子量小于1500Da的低分子量壳寡糖，产物收率高达105％(该反应是水合反应，每一个化学键断裂，都会有一个水分子加入到了产物中，因此最终产率高于100％)。进一步，所述反应体系中，底物终浓度为100g/L，所述催化剂用量为5U/ml。进一步，本专利技术所述催化剂按如下方法制备：(1)将含双功能葡聚糖酶编码基因的重组工程菌(枯草芽孢杆菌BS168)单菌落接种至LB液体培养基，37℃、200rpm转速摇床培养过夜(10小时)，获得种子液；(2)将种子液以十分之一体积的接种量接种至装有5升发酵培养基的发酵罐中，37℃，搅拌桨转速200rpm，通气量20升/分钟，培养12小时至OD600＝2，加入终浓度2mg/ml的D-木糖作为诱导剂，相同条件下(37℃，搅拌桨转速200rpm，通气量20升/分钟)培养诱导48小时，高速离心机10000rpm离心发酵液，弃菌体，收集上清液，通过微孔滤膜(孔径0.22微米)和陶瓷膜(孔径0.1微米)先后过滤处理后，获得澄清粗酶液；所述发酵培养基质量组成：5％玉米淀粉，1％工业蛋白胨，0.5％玉米浆干粉，1％(NH4)2SO4，0.2％MgSO4，0.5％NaCl，溶剂为去离子水，pH值7.0；(3)采用DEAEsepharose阴离子交换树脂对粗酶液进行纯化，以pH6、20mMTris-HCl缓冲液为平衡液，目的蛋白的洗脱液为含100mMNaCl的pH6、20mMTris-HCl缓冲液，洗脱后收集含有目的蛋白的洗脱液，即为催化剂。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术的新型耐高温双功能葡聚糖酶的耐热性能良好，最适作用温度55℃，耐高温性能超过已有的商品化壳聚糖降解酶。PRG酶是一种优良的酸性壳聚糖水解酶，在pH2.0-6.5的条件下水解壳聚糖底物时的酶活稳定，最佳催化pH值为5.0，恰好能够满足配置高浓度壳聚糖底物所需的酸性环境要求(pH5.0左右)。PRG酶能够高效水解100g/L的高浓度壳聚糖底物，8小时内彻底水解底物，产物为分子量在1500Da以下的低分子量壳寡糖，而且没有单糖副产物产生。本专利技术的新型耐高温重组双功能葡聚糖酶通过枯草芽孢杆菌表达系统高效分泌表达后能够达到较高的发酵水平，酶活力能够达到1000U/ml，大大高于目前壳聚糖水解酶的普遍生产水平(10-100U/ml)。本专利技术首次使用枯草芽孢杆菌表达系统发酵生产壳聚糖酶，发酵原料价格低廉，生产周期较短(3天左右)，上清液直接收集粗酶液，可直接用于实际生产，整体工艺路线简单。本专利技术的新型耐高温重组双功能葡聚糖在壳寡糖工业生产中使用可大大降低生产成本，显示出更大的应用潜力。(四)附图说明图1枯草芽孢杆菌重组载体图谱。图2枯草芽孢杆菌表达双功能葡聚糖酶的纯化蛋白电泳图，泳道M为中分子量蛋白marker，1为不带重组质粒BS168菌株发酵液上清，2为带有重组质粒的BS168菌株发酵液上清，3为经过超滤和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶，其特征在于所述双功能葡聚糖酶氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶，其特征在于所述双功能葡聚糖酶氨基酸序列为SEQIDNO.1所示。2.一种权利要求1所述具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。3.一种由权利要求2所述具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶编码基因构建的重组载体。4.一种由权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。5.一种权利要求1所述具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶在降解壳聚糖生产壳寡糖中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用以含双功能葡聚糖酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的上清液提取的纯酶为催化剂，以壳聚糖为底物，以pH5.0、100mM醋酸-醋酸钠缓冲液为反应介质构成反应体系，50℃反应8小时，反应液经陶瓷微滤膜过滤后，滤液冷冻干燥，获得壳寡糖。7.如权利要求6所述的的应用，其特征在于所述反应体系中，底物终浓度为100g/L，所述催化剂用量为5U/ml。8.如权利要求6所述的的应用，其特征在于所...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡登兵，缪长征，金鹏，
申请(专利权)人：菩蕊生物科技明光有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34