【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物
,具体地涉及一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法。
技术介绍
微生物在牛乳生产链过程中分泌的胞外耐热蛋白酶会导致牛乳及制品产生凝胶,沉淀和变苦。现有的脱脂乳平板筛查技术,利用向培养基中添加脱脂乳,通过对微生物的培养,观察是否有水解圈的形成来判断微生物的酪蛋白水解活力,操作简单,但是只能检测微生物是否有酪蛋白水解活力,而不能精确定量地检测和比较酪蛋白水解活力。现有的偶氮酪蛋白检测技术,利用微生物对偶氮酪蛋白底物的降解,释放具有特定紫外吸收波长的产物,通过检测产物的紫外吸收值,同时结合检测菌体生长浓度,可以实现对微生物酪蛋白水解活力的定量检测,但是由于需要同时检测菌体浓度,导致检测过程复杂且不能实现批量检测。最近报道的偶氮酪蛋白检测技术直接对培养基上清进行检测,可以不依赖菌体浓度,能够对胞外蛋白酶的酪蛋白水解活力定量测试,但未能对其酪蛋白水解活力及耐热性同时进行定量、批量检测未能实现对胞外蛋白耐热性的检测,且在菌株复壮培养中,培养基体积在5-8毫升,需要用试管培养,不利于批量操作。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服目前检测胞外蛋白酶活性的方法不能同时批量地检测胞外蛋白酶耐热性,提供了一种检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法。本专利技术的检测胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法可以1)可以同时对微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性< ...
【技术保护点】
一种同时、批量检测微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:(1)将微生物培养液离心、取上清液;(2)将一部分步骤(1)所述上清液90‑100℃加热1‑3分钟,得经过热处理的上清液,剩余的步骤(1)所述上清液为未经过热处理的上清液;(3)将步骤(2)中所述经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液按体积比1∶0.5‑1∶2分别混合,所述反应缓冲液的组分为2‑4.5g/L偶氮酪蛋白、25‑45mM吗啉丙磺酸和1.5‑3mM氯化钙,35‑45℃反应2‑3小时,加入1.5‑3M三氯乙酸溶液或三氟乙酸终止反应,离心,取上清转移至多孔板,向所述上清中加入强碱溶液至强碱终浓度为0.2‑0.5M,分别检测450nm吸光值;(4)将步骤(3)所得450nm吸光值分别换算为步骤(2)所述经过热处理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性,所述换算的方法为将样品在450nm处的吸光值减去空白对照在450nm的吸光值得吸光值增值,再将所述吸光值增值换算为每毫升样品每小时的吸光值增值即得所述胞外蛋白酶酪蛋白水解活性;所述胞外蛋白酶的耐热性为所得经过热处理与未经过热处 ...
【技术特征摘要】 【专利技术属性】
1.一种同时、批量检测微生物胞外蛋白酶酪蛋白水解活性及耐热性的
方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)将微生物培养液离心、取上清液;
(2)将一部分步骤(1)所述上清液90-100℃加热1-3分钟,得经过热处
理的上清液,剩余的步骤(1)所述上清液为未经过热处理的上清液;
(3)将步骤(2)中所述经过与未经过热处理的上清液与反应缓冲液按体
积比1∶0.5-1∶2分别混合,所述反应缓冲液的组分为2-4.5g/L偶氮酪蛋白、
25-45mM吗啉丙磺酸和1.5-3mM氯化钙,35-45℃反应2-3小时,加入1.5-
3M三氯乙酸溶液或三氟乙酸终止反应,离心,取上清转移至多孔板,向所
述上清中加入强碱溶液至强碱终浓度为0.2-0.5M,分别检测450nm吸光值;
(4)将步骤(3)所得450nm吸光值分别换算为步骤(2)所述经过热处
理与未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性,所述换算的方
法为将样品在450nm处的吸光值减去空白对照在450nm的吸光值得吸光值
增值,再将所述吸光值增值换算为每毫升样品每小时的吸光值增值即得所述
胞外蛋白酶酪蛋白水解活性;所述胞外蛋白酶的耐热性为所得经过热处理与
未经过热处理的上清液中的胞外蛋白酶酪蛋白水解活性的比值。
2.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(1)中,所述微生物培
养液通过包括以下步骤的方法获得:
1)将微生物接种于复壮培养基中30℃培养24h,得复壮培养液;
2)将步骤1)所述复壮培养液转接至灭菌脱脂乳,30℃继续培养48h,
即得。
3.如权利要求2所述方法,其特征在于,步骤1)中,所述复壮培养基
为MPC培养基,所述MPC培养基的组分为5.0g/L胰化蛋白胨、2.5g/L酵母
技术研发人员:徐煜,刘振民,游春苹,
申请(专利权)人:光明乳业股份有限公司,
类型:发明
国别省市:上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。