一种盐适应性改良的内切木聚糖酶改组突变体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及基因工程及蛋白质改造技术领域，具体来说是一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体及其制备方法和应用，突变体S35H04的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其最适pH为5.0，最适温度为65℃，50℃时的半衰期为30min。与野生酶相比，突变内切木聚糖酶S35H04在10.0mM的β‑Mercaptoethanol、CoCl

A salt adaptability improved endo xylanase mutant reorganization and preparation method and application thereof

The present invention relates to the technical field of gene engineering and protein engineering, in particular to an improved salt adaptability of Endo xylanase mutant and its preparation method and the application of mutant S35H04 amino acid sequence of SEQ ID NO.1 shows, the optimum pH was 5, the optimum temperature is 65 DEG, 50 DEG C when the half-life of 30min. Compared with the wild-type enzyme, endo xylanase S35H04 mutation in 10.0mM beta Mercaptoethanol, CoCl

【技术实现步骤摘要】
一种盐适应性改良的内切木聚糖酶改组突变体及其制备方法和应用
本专利技术涉及基因工程及蛋白质改造
，具体来说是一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体及其应用。
技术介绍
木聚糖主链是由木糖聚合而成的多聚糖，侧链含有L-阿拉伯糖等残基。木聚糖是半纤维素中最丰富的一种多糖，广泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麦麸、秸秆等作物资源中，最高可占植物细胞干重的三分之一。内切木聚糖酶可降解木聚糖主链结构，产生木寡糖和/或木糖，可应用于食品、酿酒、饲料、纺织及造纸等领域(Collinsetal.FEMSMicrobiolRev,2005,29:3–23.)。耐盐酶可应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物
，如腌制食品加工、高盐稀态酱油发酵、洗涤等；在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节省灭菌等所消耗的能源(Margesin和Schinner,Extremophiles,2001,5:73–83.)。但由于高盐浓度下的盐析作用，大部分的酶在高盐浓度下不具有良好的催化活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体S35H04，所述突变体S35H04的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。进一步的，所述突变体S35H04的最适pH为5.0，最适温度为65℃，50℃时的半衰期为30min，在20.0-25.0％(v/v)的NaCl中具有62-69％的活性，在10.0-30.0％(w/v)的KCl中具有103-112％的酶活。本专利技术的第二目的是提供一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体S35H04的编码基因s35h04，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第三目的是提供一种包含内切木聚糖酶突变体S35H04编码基因s35h04的重组载体。本专利技术的第四目的是提供一种包含内切木聚糖酶突变体S35H04编码基因s35h04的重组菌。本专利技术的第五目的是提供一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体S35H04在食品领域中的应用。本专利技术还提供一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体S35H04的制备方法，按以下步骤进行：1)将s35h04和表达载体pEasy-E2相连接，并将连接产物转化大肠杆菌BL21-Gold(DE3)，获得包含s35h04的重组菌株；2)培养重组菌株，诱导重组突变内切木聚糖酶表达；3)回收并纯化所表达的突变内切木聚糖酶S35H04。4)活性测定。本专利技术的有益技术效果是：与野生酶相比，突变内切木聚糖酶S35H04的盐适应性发生了改变。纯化的突变酶S35H04、野生酶rXynAGN16L和rXynAHJ3的最适pH分别为5.0、5.5和6.0，最适温度分别为65℃、50℃和75℃；内切木聚糖酶rXynAHJ3在50℃时稳定，rXynAGN16L在50℃时极不稳定，S35H04在50℃时的半衰期约为30min。在10.0mM的β-Mercaptoethanol、CoCl2和FeSO4中，突变体S35H04的酶活比野生酶rXynAHJ3的酶活分别高24％、25％和37％；在20.0–25.0％(w/v)的NaCl中，突变体S35H04的酶活比野生酶rXynAHJ3和rXynAGN16L的酶活高18-33％；在10.0–30.0％(w/v)的KCl中，突变体S35H04的酶活比野生酶rXynAHJ3的酶活高15–30％，比野生酶rXynAGN16L的酶活高25–55％。本专利技术的突变内切木聚糖酶S35H04可应用于食品行业、海产品加工和高盐环境生物
附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1：在大肠杆菌中表达的重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S35H04的SDS-PAGE分析，其中，CK：蛋白质Marker；图2：重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S35H04的pH活性；图3：重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S35H04的pH稳定性；图4：重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S35H04的热活性；图5：重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S35H04的热稳定性；图6：重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S35H04在NaCl中的活性；图7：重组内切木聚糖酶rXynAGN16L、rXynAHJ3及其突变体S35H04在KCl中的活性。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。试验材料和试剂1、菌株及载体：大肠杆菌EscherichiacoliBL21-Gold(DE3)和表达载体pEasy-E2购自北京全式金生物技术有限公司；节杆菌(Arthrobactersp.)和列舍瓦里尔菌(Lechevalieriasp.)由云南师范大学提供。2、酶类及其它生化试剂：DNA聚合酶及dNTP购自北京全式金生物技术有限公司，山毛榉木聚糖购自Sigma公司，玉米芯木聚糖购自上海源叶生物科技有限公司，易错PCR试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司，细菌基因组提取试剂盒购自GENESTAR公司，PopCultureTM细胞裂解液购自德国默克集团有限公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基：LB培养基：Peptone10g，Yeastextract5g，NaCl10g，加蒸馏水至1000mL，pH自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0％(w/v)琼脂。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。实施例1：突变文库的构建①按照GENESTAR公司细菌基因组提取试剂盒说明书提取节杆菌(Arthrobactersp.)和列舍瓦里尔菌(Lechevalieriasp.)基因组。②根据GenBank记录的节杆菌(Arthrobactersp.)内切木聚糖酶核苷酸序列JQ863105(SEQIDNo.3)，设计引物5'GTGCAGCCGGAGGAAAAACG3'和5'GATGAAGGCAGGATCCGGGGT3'，以节杆菌(Arthrobactersp.)基因组为模板进行PCR扩增，获得内切木聚糖酶基因xynAGN16L；另根据GenBank记录的列舍瓦里尔菌(Lechevalieriasp.)内切木聚糖酶核苷酸序列JF745868(SEQIDNo.4)，设计引物5'GTCTCGGCCCCGCCGGACGT3'和5'GGCTCGCTTCGCCAGCGTGG3'，以列舍瓦里尔菌(Lechevalieriasp.)基因组为模板进行PCR扩增，获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体S35H04，其特征在于，所述突变体S35H04的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体S35H04，其特征在于，所述突变体S35H04的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述内切木聚糖酶突变体S35H04，其特征在于，所述突变体S35H04的最适pH为5.0，最适温度为65℃，50℃时的半衰期为30min，在20.0-25.0％(v/v)的NaCl中具有62-69％的活性，在10.0-30.0％(w/v)的KCl中具有103-112％的酶活。3.一种编码权利要求1所述盐适应性改良的内切木聚糖酶突变体S35H04的编码基因s35h04，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。4.根据权利要求2所述包含内切木聚糖酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：周峻沛，黄遵锡，张蕊，何丽梅，唐湘华，李俊俊，吴倩，沈骥冬，
申请(专利权)人：云南师范大学，
类型：发明
国别省市：云南,53