一种α‑葡萄糖苷酶的高效制备方法技术

本发明专利技术提供的是一种α‑葡萄糖苷酶的高效制备方法，以微生物或植物来源的α‑葡萄糖苷酶基因碱基序列为依据，筛选获得催化性能显著提升的α‑葡萄糖苷酶编码基因，然后再通过引入强启动子和高分泌效率信号肽元件，借助重构的表达质粒增加α‑葡萄糖苷酶基因拷贝数，获得了高效分泌表达α‑葡萄糖苷酶的重组菌，结合酶活力差异性筛选获得活力最高的菌株；结合该菌株的生长特征和产酶特征建立30m

A high alpha glucosidase preparation method

The invention provides a system is efficient alpha glucosidase preparation method to alpha glucosidase gene sequences of microbial or plant origin on the basis of screening of alpha glucosidase gene encoding significantly enhance the catalytic performance, and then through the introduction of a strong promoter and high efficiency signal peptide components. With the reconstruction of the expression plasmid increased alpha glucosidase gene copy number, the efficient secretion of recombinant bacteria expressing alpha glucosidase, combined with enzyme activity difference screened the most active strain; combining the strain growth characteristics and enzyme producing characteristics of the establishment of 30m

【技术实现步骤摘要】
一种α-葡萄糖苷酶的高效制备方法
本专利技术提供一种α-葡萄糖苷酶的高效制备方法，属于微生物、基因工程领域。
技术介绍
α-葡萄糖苷酶，又称葡萄糖基转移酶（α-glucosidase,EC.3.2.1.20），系统命名为α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。它在糖的催化反应中具有水解和转糖苷的双重作用。水解作用可从α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非还原性末端切开α-1,4糖苷键，释放出葡萄糖；转糖苷作用又可将游离出的葡萄糖残基以α-1,6糖苷键转移到另一个葡萄糖或麦芽糖类底物上，从而得到非发酵性的低聚异麦芽糖（简称IMO）。自20世纪80年代日本从黑曲霉中筛选出α-葡萄糖苷酶生产菌种，并得以工业化生产酶制剂以来，α-葡萄糖苷酶在基础研究和工业生产上发挥着越来越重要的作用。目前，国外生产的α-葡萄糖苷酶大部分为纯酶，酶活较高；而国内主要以粗酶液为主，酶活较低。而且，国内尚未有商品化α-葡萄糖苷酶酶制剂出售，用于生产的酶均来自国外少数几个酶制剂厂，进口价格昂贵，导致IMO的生产成本居高不，一定程度上制约了我国IMO产业的发展。选育α-葡萄糖苷酶的高产菌种并建立相应的高效制备工艺是实现α-葡萄糖苷酶低成本商业化制造的关键所在。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种α-葡萄糖苷酶的高效制备方法。以微生物或植物来源的α-葡萄糖苷酶基因碱基序列为依据，参考目标宿主菌的密码子偏好性进行密码子优化，并通过采用长引物和低温易错PCR的筛选获得催化性能显著提升的α-葡萄糖苷酶编码基因，然后再通过引入强启动子和高分泌效率信号肽等元件，借助重构的表达质粒增加α-葡萄糖苷酶基因拷贝数，获得了高效分泌表达α-葡萄糖苷酶的重组菌，结合酶活力差异性筛选获得活力最高的菌株。结合该菌株的生长特征和产酶特征建立30m3发酵体系下的α-葡萄糖苷酶高效分泌表达工艺。上述α-葡萄糖苷酶基因的获得方式既可以是以来源微生物的染色体DNA为模板PCR扩增获得，也可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列采用全基因合成的方法获得，更可以是以上述来源微生物染色体DNA上的核酸序列为依据结合目标宿主菌的密码子偏好型的重新设计并合成。上述获得的优选后的α-葡萄糖苷酶基因克隆表达的目标宿主菌为可高效分泌表达多种蛋白的菌株，且该目标菌株可以根据需要进行遗传修饰。目标宿主菌可以是黑曲霉，烟曲霉，米曲霉，地衣芽胞杆菌，枯草芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌，酿酒酵母，毕赤酵母等，也可以是其他食品安全微生物。上述获得的优选后的α-葡萄糖苷酶基因可以在目标宿主菌自身优势基因的启动子序列下游进行高效转录过程。优势基因的启动子可是来源于目标宿主菌的蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，糖苷酶，等等相关基因的操纵子。上述获得的优选后的α-葡萄糖苷酶基因可以在目标宿主菌自身优势基因的信号肽序列下游进行高效分泌表达过程。优势基因的信号肽可是来源于目标宿主菌的蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，糖苷酶，等等相关基因的操纵子。上述用于优选后的α-葡萄糖苷酶基因高效表达的质粒载体可以是1-4个拷贝的质粒，也可以是400个拷贝左右的质粒，更可以是温度诱导调控型质粒整体。更重要的是该质粒载体同时携带了在目标宿主菌和大肠杆菌中高效复制需要的复制子，便于质粒在目标宿主菌中的高拷贝复制。获得重组可以在简单发酵工艺下实现目标蛋白在30m3发酵体系下的高效制备。优选的，所述微生物或植物来源的α-葡萄糖苷酶基因为黑曲霉α-葡萄糖苷酶的编码基因agA，agB，agC，agD，agE，agF。采用的长引物序列如下：agXtemP1：ATGGTTAAACTGCCCTTTAACATCCAAATGTTTTCTACTTCCATTACGG；agXtemP2：TTACCATTCAAACGTTAGTTGAAACGAACGTAACGAGAGTCAACATCCCA。优选获得的催化性能显著提升的α-葡萄糖苷酶编码基因序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的有益效果在于：本专利技术中所使用的α-葡萄糖苷酶其编码基因经过密码子优化等策略改造并通过催化性能筛选获得，具备高催化性能等特点。本专利技术中所使用的α-葡萄糖苷酶的表达方法，特别是筛选获得高强度启动子的表达方法可以保证α-葡萄糖苷酶转录过程的高水平和后续表达过程的高表达量。本专利技术中所使用的α-葡萄糖苷酶的表达方法，特别是筛选获得分泌性能优良的信号肽的表达方法可以保证α-葡萄糖苷酶分泌过程的高效性和后续表达过程的高表达量。本专利技术中所使用的α-葡萄糖苷酶的表达方法，特别是高拷贝穿梭型质粒的表达方法既可保证重组质粒在构建过程中的便捷性，也可保证目标宿主菌中表达过程的高表达量。本专利技术中所获得的α-葡萄糖苷酶的高产菌株具备生长和产酶特性稳定，发酵产酶过程易于放大生产的特征。本专利技术中所形成的α-葡萄糖苷酶制备工艺，具备工艺简单，操作稳定等特点，大大降低操作难度，节约经济成本。本专利技术所形成的α-葡萄糖苷酶制备工艺，可实现10吨到30吨及更大规模的高活性α-葡萄糖苷酶的高效制备过程。附图说明图1所示的是筛选获得的α-葡萄糖苷酶编码基因高效表达质粒的物理图谱。图2所示的是筛选获得的多个α-葡萄糖苷酶最适作用pH的差异性。图3所示的是筛选获得的多个α-葡萄糖苷酶最适作用温度的差异性。图4所示的是α-葡萄糖苷酶用于制备低聚异麦芽糖浆组份分析图谱。具体实施方式以下实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制。（1）采用Thermofisher公司的TRIZol®PlusRNA纯化系统将TRIzol®试剂的裂解能力与PureLink®RNA小量提取试剂盒硅胶离心柱方便的RNA提取技术相结合，快速分离提取黑曲霉总RNA。（2）在逆转录酶试剂盒EnzChek®ReverseTranscriptaseAssayKit的作用下合成cDNA，以上述cDNA为模板分别使用引物对agA1/agA2；agB1/agB2；agC1/agC2；agD1/agD2；agE1/agE2；agF1/agF2获得α-葡萄糖苷酶的编码基因agA，agB，agC，agD，agE，agF（各序列信息分贝为XM_001396469.2、XM_001393862.2、XM_001391091.2、XM_001402016.2、XM_001400418.2、XM_001388877.2）。（3）上述获得的α-葡萄糖苷酶的编码基因克隆入pPIC9K质粒的SnaBI/EcoRI位点中获得重组质粒pPIC-agA~F。（4）将重组质粒pPIC-agA~F线性化后电击转化的方式在毕赤酵母GS115中整合表达。并通过组氨酸营养缺陷型筛选和G418抗性筛选获得阳性转化子。（5）将上述获得的阳性转化子采用Thermofisher（Invitrogen）公司提供的毕赤酵母操作手册阳性转化子发酵验证方法制备酶液。测定酶液中的α-葡萄糖苷酶酶活并进一步筛选目标转化子。（6）以筛选获得的目标转化子其氨基酸序列为依据，参考枯草芽胞杆菌的密码子偏好性优化上述基因的核酸序列，密码子优化过程中消除原有基因中已有的SmaI和EcoRI位点同时不形成新的上述两个酶切位点，并通过全基因合成的方式获得酶活最优的相关α-葡萄糖苷酶编码基因。（7）以上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α‑葡萄糖苷酶的高效制备方法，其特征在于：以微生物或植物来源的α‑葡萄糖苷酶基因碱基序列为依据，参考目标宿主菌的密码子偏好性进行密码子优化并通过采用长引物和低温易错PCR的筛选获得催化性能显著提升的α‑葡萄糖苷酶编码基因，然后再通过引入强启动子和高分泌效率信号肽元件，借助重构的表达质粒增加α‑葡萄糖苷酶基因拷贝数，获得了高效分泌表达α‑葡萄糖苷酶的重组菌，结合酶活力差异性筛选获得活力最高的菌株；结合该菌株的生长特征和产酶特征建立30m

【技术特征摘要】
1.一种α-葡萄糖苷酶的高效制备方法，其特征在于：以微生物或植物来源的α-葡萄糖苷酶基因碱基序列为依据，参考目标宿主菌的密码子偏好性进行密码子优化并通过采用长引物和低温易错PCR的筛选获得催化性能显著提升的α-葡萄糖苷酶编码基因，然后再通过引入强启动子和高分泌效率信号肽元件，借助重构的表达质粒增加α-葡萄糖苷酶基因拷贝数，获得了高效分泌表达α-葡萄糖苷酶的重组菌，结合酶活力差异性筛选获得活力最高的菌株；结合该菌株的生长特征和产酶特征建立30m3发酵体系下的α-葡萄糖苷酶高效分泌表达方法。2.根据权利要求1所述的一种α-葡萄糖苷酶的高效制备方法，其特征在于：所述微生...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛丹丹，叶秀云，
申请(专利权)人：福建福大百特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35