一种新型β‑淀粉酶的高效制备方法技术

本发明专利技术提供了一种新型β‑淀粉酶的高效制备方法。根据大麦β‑淀粉酶编码基因

【技术实现步骤摘要】
一种新型β-淀粉酶的高效制备方法
本专利技术提供了一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，属于基因工程、发酵工程领域。
技术介绍
植物来源的β-淀粉酶活性高，耐热性好、应用pH范围更广，目前工业上应用的β-淀粉酶大多还是通过植物提取获得的β-淀粉酶。从植物中提取β-淀粉酶目前主要有水提和油提两种方法，其中油提法(甘油)与水提法相比，具有提取时间短、酶的保存时间长等优点，但成本较高，生产中常采用水提法提取β-淀粉酶。目前商品化推广比较成功的β-淀粉酶为Genencor杜邦公司生产的麦芽β-淀粉酶，是采用典型的大麦提取工艺制造方法制得。但由于β-淀粉酶在大麦中中的含量较低，提取成本偏高，且所有这些酶制剂提取物都或多或少含有其它无关淀粉水解酶，如α-淀粉酶、糖化酶等，影响其使用效果（麦芽糖浆中含有较高浓度的葡萄糖）。微生物发酵生产的β-淀粉酶不受季节、原料等影响，可实现自动化控制批量生产，使生产出的β-淀粉酶性能稳定、均一，是β-淀粉酶产业化制造的最佳选择之一。但是由于微生物发酵生产的β-淀粉酶活性相对较低，耐热性差，产酶水平太低以及其最适作用温度偏低，一直未能实现工业化生产。国内外很早就通过物理、化学方法诱变提高产酶活力和热稳定性及改变菌种的发酵条件来提高酶活力，然而已有的微生物来源β-淀粉酶生产离工业化还有较大距离。特别是在β-淀粉酶高产菌株的构建和β-淀粉酶耐热性能等催化特征改良方面仍不成熟。巴斯德毕赤酵母表达系统是一种甲醇营养型酵母表达系统，是一种相对较成熟的真核蛋白表达体系，被广泛用于各种外源蛋白的表达。毕赤酵母中含有强有力的AOX1启动子，像大肠杆菌一样能够调控表达外源蛋白，同时作为一种真核表达系统，外源基因是通过质粒线性化后整合到自身基因组上，得到的重组菌遗传稳定性好；可以对蛋白进行恰当的翻译后，对其进行加工与修饰，促进蛋白正确折叠，因此比原核表达的蛋白更能贴近天然状态，并维持蛋白稳定的天然构象，从而使表达出的蛋白具有生物活性，而且活性较高，这对于蛋白高效表达有着十分重要的作用；不仅如此，由于分泌信号肽α-Factor的存在，重组毕赤酵母表达的外源蛋白绝大部分可分泌到胞外，且自身分泌的内源蛋白少，使得外源蛋白分离纯化简便。与酿酒酵母相比，毕赤酵母表达的蛋白糖基化程度低，不会产生过度糖基化，因此对于蛋白的临床应用具有很大优势。除此之外，在应用毕赤酵母表达外源蛋白时操作简单、营养要求低、周期短、易于培养，高密度发酵技术成熟，便于工业化生产。本专利技术利用分子克隆技术实施大麦β-淀粉酶在毕赤酵母中的异源表达并通过简单易行碱基突变新方法获得了耐热性能大幅度提高的新型β-淀粉酶变异体，并将该变异体在毕赤酵母中的高效表达，获得耐热型β-淀粉酶高效制造新技术。
技术实现思路
本专利技术为一种新型β-淀粉酶的高效制备方法。本专利技术通过NCBI公布的大麦β-淀粉酶编码基因bba碱基序列和酿酒酵母的密码子偏好性，对上述bba基因进行密码子优化并全基因合成新的bbaP基因，克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC-bbaP，在巴斯德毕赤酵母GS115中实现整合表达，并通过His+筛选、淀粉透明圈筛选及G418抗性筛选，获得了高分泌表达大麦β-淀粉酶的重组巴斯德毕赤酵母GS-bbaP。对该重组酵母进行摇瓶发酵，在0.5%(v/v)甲醇诱导条件下发酵120h，分泌表达β-淀粉酶酶活水平为70~80U/mL的。获得重组β-淀粉酶的最适作用温度为55℃，最适作用pH为5.0。通过采用非高保真的DNA聚合酶在低退火温度下（45~50℃）对上述获得bbaP实施易错PCR，获得的新基因bbaPT克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC-bbaPT，在巴斯德毕赤酵母GS115中实现整合表达，并通过His+筛选、淀粉透明圈筛选及G418抗性筛选，获得了最适作用温度显著提高的β-淀粉酶的重组菌。获得重组β-淀粉酶的最适作用温度为65℃，最适作用pH为5.0。对该重组酵母GS-bbaPT29进行摇瓶发酵，15L小试发酵和30m3大罐发酵生产。65℃条件下测定酶活力，最高酶活力达280U/mL。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，包括如下具体步骤：（1）β-淀粉酶基因的获得：通过NCBI公布的大麦β-淀粉酶编码基因bba碱基序列和酿酒酵母的密码子偏好性，对上述bba基因进行密码子优化并全基因合成新的bbaP基因；（2）克隆：将步骤（1）所得bbaP基因克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC-bbaP；（3）易错PCR：采用非高保真的DNA聚合酶在45~50℃低退火温度下对上述获得bbaP实施易错PCR，获得的新基因bbaPT；（4）表达：将步骤（3）所得新基因bbaPT克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC-bbaPT，在巴斯德毕赤酵母GS115中实现整合表达；（5）耐热新型β-淀粉酶的筛选：通过His+筛选、淀粉透明圈筛选及G418抗性筛选，再通过摇瓶发酵和酶活测定获得最适作用温度显著提高的β-淀粉酶的重组酵母GS-bbaPT29；（6）耐热新型β-淀粉酶的发酵生产：发酵培养，分离纯化得到耐热新型β-淀粉酶。其中，步骤（4）所述巴斯德毕赤酵母是一种能高效表达、分泌β-淀粉酶的毕赤酵母基因工程菌株，其染色体DNA上整合一条耐热新型β-淀粉酶编码基因。步骤（5）所述的重组酵母GS-bbaPT29的耐热新型β-淀粉酶编码基因如SEQIDNo.1所示。所述步骤（6）的发酵条件为：30m3大罐发酵生产，发酵培养基为BSM培养基，每升BSM培养基中加入12mL微量元素PTM1母液，发酵温度为30℃，pH维持5.0；DO维持20%以上；流加甲醇诱导产酶70~96h后发酵结束；按照前述耐热型β-淀粉酶活力测定产酶水平，65℃条件下测定酶活力，最高酶活力达280U/mL。本专利技术的显著优点1、本专利技术获得耐热型β-淀粉酶新基因的方法具有易实施、易获得、催化活性高效等特点。2、本专利技术获得耐热型β-淀粉酶新基因的方法可以为筛选高活性β-淀粉酶、耐酸或耐碱β-淀粉酶、耐热或低温β-淀粉酶等提供丰富的可筛选基因文库。3、本专利技术基于毕赤酵母高效表达系统的新工艺有助于β-淀粉酶工业生产中的高效制备。4、本专利技术的工业化生产过程使用的为无机盐全合成培养基，分泌表达的β-淀粉酶产品易于分离纯化和成品制备。5、本专利技术的重组蛋白为工业酶制剂β-淀粉酶，进一步为大宗工业酶制剂，如淀粉酶、普鲁兰酶、纤维素酶、半纤维素酶、植酸酶、果胶酶、脂肪酶、蛋白酶、糖苷酶、核酸酶、RNA酶等，但不局限于上述酶制剂。附图说明图1：pPIC-bbaPT质粒构建示意图；图2：鉴定平板筛选产酶菌株；图3：15L发酵体系下耐热型β-淀粉酶高产菌株GS-bbaPT29产酶进程。具体实施方式：为了实现上述目的，本专利技术采用的实验方法如下：1、培养基配置大肠杆菌培养基LB培养基，培养条件200r/min，37℃；酵母培养基YPD培养基，富集培养基BMGY，诱导培养基BMMY，培养条件230r/min，28~30℃；酵母筛选固体培养基MD，培养条件28~30℃。大肠杆菌培养基：0.5%(w/v)酵母提取物，1%(w/v)胰蛋白陈，1%(w/v)NaC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型β‑淀粉酶的高效制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：（1）β‑淀粉酶基因的获得：通过NCBI公布的大麦β‑淀粉酶编码基因

【技术特征摘要】
1.一种新型β-淀粉酶的高效制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：（1）β-淀粉酶基因的获得：通过NCBI公布的大麦β-淀粉酶编码基因bba碱基序列和酿酒酵母的密码子偏好性，对上述bba基因进行密码子优化并全基因合成新的bbaP基因；（2）克隆：将步骤（1）所得bbaP基因克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC-bbaP；（3）易错PCR：采用非高保真的DNA聚合酶在45~50℃低退火温度下对上述获得bbaP实施易错PCR，获得的新基因bbaPT；（4）表达：将步骤（3）所得新基因bbaPT克隆入pPIC9K载体中构建重组表达质粒pPIC-bbaPT，在巴斯德毕赤酵母GS115中实现整合表达；（5）耐热新型β-淀粉酶的筛选：通过His+筛选、淀粉透明圈筛选及G418抗性筛选，再通过摇瓶发酵和酶活测定获得最适作用温度显著提高的β-淀粉酶的重组酵母GS-bbaPT29；（6）耐热新型β-淀粉酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：牛丹丹，叶秀云，
申请(专利权)人：福建福大百特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35