一种α‑淀粉酶Amy16及其基因和应用，涉及淀粉酶。所述α‑淀粉酶Amy16分离自太平洋火色杆菌H2；α‑淀粉酶Amy16的制备：1)克隆α‑淀粉酶基因amy16，将α‑淀粉酶基因amy16插入表达载体，构建携带α‑淀粉酶基因amy16的重组表达载体；将α‑淀粉酶基因amy16的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选取转化后大肠杆菌BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；离心收集发酵后的大肠杆菌BL21细胞，重悬大肠杆菌BL21细胞于裂解缓冲液中裂解，将裂解后的悬液离心，收集上清液；将所得上清液纯化，即得所述α‑淀粉酶Amy16。所述α‑淀粉酶Amy16可在制备淀粉降解剂中应用。
【技术实现步骤摘要】
一种α-淀粉酶Amy16及其基因和应用
本专利技术涉及淀粉酶，尤其是涉及分离自太平洋火色杆菌(FlammeovirgaPacifica)H2具有热稳定性和强碱耐受性的一种α-淀粉酶Amy16及其基因和应用。
技术介绍
淀粉酶是一类能够水解淀粉产生糊精以及更小的多糖单位或单糖的酶类总称。根据作用方式的不同，淀粉酶可以分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶(EC.3.2.1.1)属于糖苷水解酶13家族，能够通过随机酶切α-1,4-糖苷键来降解长链淀粉。基于序列和底物特异性的不同，还可以将α-淀粉酶进一步地分为35个α-淀粉酶亚家族。α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，但目前应用于工业的α-淀粉酶大多来自于微生物。对α-淀粉酶的研究已经有半个多世纪，目前，α-淀粉酶已是最重要的工业酶制剂之一，已被广泛应用在食品、洗涤剂、发酵、纺织、造纸和制药等诸多行业。α-淀粉酶的一个重要工业应用是在食品加工行业中被用来处理降解淀粉类物质。目前在工业上大量使用的α-淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、黑曲霉(Aspergillusniger)和米曲霉(Aspergillusoryzae)。这些酶大多具有耐高温甚至耐超高温的特性，它们的应用可以简化淀粉加工工艺，降低加工成本；另一方面，高温发酵罐的高生产成本和设备、发酵技术等瓶颈也严重限制了高温α-淀粉酶的大规模发酵以及在淀粉加工行业的进一步应用(VanDerMaarel,M.J.,B.VanDerVeen,etal.(2002)."Propertiesandapplicationsofstarch-convertingenzymesoftheα-amylasefamily."JournalofBiotechnology94(2):137-155)。因此近年来，中温淀粉酶也受到了越来越多的关注。虽然我国上世纪70年代已有了α-淀粉酶工业化生产，相继开发出多种中温淀粉酶，但大部分淀粉酶的酶学性质仍无法完全满足现代工业的需求。中国专利CN102925420B公开一种α淀粉酶及表达α淀粉酶的重组菌株，所述的α淀粉酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1，其编码核苷酸序列为SEQIDNO:1。用于表达α淀粉酶的黑曲霉P15，其保藏编号为CGMCCNo.6434。该专利技术所得到的重组菌种能够表达棒曲霉α淀粉酶AclaP15，其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉自身表达的淀粉酶的酶活力。同时，所得重组α淀粉酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得，扩大了AclaP15的应用领域。中国专利CN102827816B公开一种α-淀粉酶及其应用，所述的α-淀粉酶的核苷酸序列为SEQIDNO：2，氨基酸序列为SEQIDNO：1。该专利技术筛选出的α-淀粉酶在淀粉水解为麦芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产高麦芽糖浆、作为添加剂用于焙烤制品如面包的生产，以及在啤酒、黄酒和生料酒精行业等行业均有不同程度的应用，具有工业生产应用价值。而且筛选出的α-淀粉酶可以用来转化工程菌，从而获得具有表达α-淀粉酶的重组菌。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种能够应用的具有热稳定和碱耐受性强等特性的新型α-淀粉酶Amy16。本专利技术的第二目的是提供编码α-淀粉酶的基因amy16。本专利技术的第三目的是提供包含基因amy16的重组载体。本专利技术的第四目的是提供包含基因amy16的重组菌株。本专利技术的第五目的是提供α-淀粉酶Amy16的制备方法。本专利技术的第六目的是提供α-淀粉酶Amy16的应用。所述α-淀粉酶Amy16分离自太平洋火色杆菌H2(FlammeovirgaPacifica)H2，该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2012229，地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。所述α-淀粉酶Amy16的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，SEQIDNO.1如下：α-淀粉酶基因编码455个氨基酸，该酶基因表达的Amy16蛋白分子量约为52kDa。本专利技术的淀粉酶Amy16同时具有较好的热稳定性、中温条件下在中性和碱性范围内均具有高活性等特征。本专利技术筛选到的Amy16最适温度为50℃，在60℃下仍具有60％的活力，且在60℃下孵育20min后保有80％的起始活力，40min之后仍保有65％的起始活力，表明本专利技术的淀粉酶Amy16具有良好的热稳定性。Amy16的最适pH为6.5，在pH5.5～9之间的范围内维持50％以上的酶活性。此外α-淀粉酶Amy16在pH6，7，8条件下孵育1h活力基本保持不变，在pH9条件下孵育1h保有70％的起始活力，在pH10条件下孵育1h后仍保有40％的起始活力，表明了该酶具有较强的碱耐受性。由于本专利技术的淀粉酶具有良好的热稳定性和碱耐受性，且可有效地与糖化酶协同作用降解淀粉产生葡萄糖，因此可以广泛地用于食品加工、饲料、轻工等领域，具有良好的工业应用前景。编码α-淀粉酶Amy16的基因amy16的基因序列如SEQIDNO.2所示，SEQIDNO.2如下：本专利技术通过PCR方法从太平洋火色杆菌(FlammeovirgaPacifica)H2中获得淀粉酶基因amy16，该基因全长为1368bp。将淀粉酶基因amy16序列及推导出的氨基酸序列在NCBI中进行BLAST比对显示Amy16是一种新的淀粉酶。Amy16的基因序列与其他已知序列无高同源性，且Amy16的氨基酸序列只与小部分淀粉酶氨基酸序列有70％的同源性，但这些同源性为70％的淀粉酶的性质均未知。Amy16与已知性质的淀粉酶的氨基酸序列最高同源性仅为50％。包含α-淀粉酶Amy16基因amy16的重组载体为pET-His-amy16。将淀粉酶基因amy16插入到表达载体pET-His的限制性酶切位点EcoRI和HindIII之间，使该基因序列位于T7启动子的下游并受其调控，从而得到重组表达质粒pET-His-amy16。所述α-淀粉酶Amy16的制备方法，包括以下步骤：1)克隆α-淀粉酶基因amy16，将所述α-淀粉酶基因amy16插入表达载体，构建携带所述α-淀粉酶基因amy16的重组表达载体；2)将所述α-淀粉酶基因amy16的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选取转化后大肠杆菌BL21中的阳性克隆于培养基中进行发酵培养；3)离心收集发酵后的大肠杆菌BL21细胞，重悬所述大肠杆菌BL21细胞于裂解缓冲液中进行裂解，将裂解后的悬液进行离心，收集上清液；4)将步骤3)所得上清液按照纯化试剂盒说明书进行纯化，即得所述α-淀粉酶Amy16。在步骤2)中，所述培养基的组成可为：含有100μg/mL氨苄霉素和2g/L葡萄糖(w/v)的LB培养基；所述发酵培养的条件可为：温度为37℃，摇床培养至OD600＝0.6时(OD600为发酵液在600nm处的吸光度值)，再加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM，15℃诱导6h。本专利技术从太平洋火色杆菌(FlammeovirgaPacific本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种α‑淀粉酶Amy16，分离自太平洋火色杆菌H2(Flammeovirga Pacifica)H2，该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012229；所述α‑淀粉酶Amy16的氨基酸序列如SEQ ID NO.1。
【技术特征摘要】
1.一种α-淀粉酶Amy16，分离自太平洋火色杆菌(FlammeovirgaPacifica)H2，该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2012229；所述α-淀粉酶Amy16的氨基酸序列如SEQIDNO.1。2.编码α-淀粉酶Amy16的基因amy16，其基因序列如SEQIDNO.2所示。3.如权利要求1所述α-淀粉酶Amy16的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)克隆α-淀粉酶基因amy16，将所述α-淀粉酶基因amy16插入表达载体，构建携带所述α-淀粉酶基因amy16的重组表达载体；2)将所述α-淀粉酶基因amy16的重组表达载体转化到大肠杆菌BL21中，选取转化后大肠杆菌BL21中的阳性克隆于...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾润颖，周桂兰，金敏，
申请(专利权)人：国家海洋局第三海洋研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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