一种来源于海科贝特氏菌的重组溶菌酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于生物化学技术领域，具体涉及一种来源于海科贝特氏菌（Cobetia marina）的重组溶菌酶及其制备方法和应用，所述重组溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术所获得的重组溶菌酶具有良好的酶学性质，其可以应用于制备饲料添加剂、食品添加剂。食品添加剂。

【技术实现步骤摘要】
一种来源于海科贝特氏菌的重组溶菌酶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物化学
，具体涉及一种来源于海科贝特氏菌（Cobetia marina）的重组溶菌酶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]溶菌酶（EC 3.2.1.17），也称为胞壁酸酶或N
‑
乙酰胞壁质聚糖水解酶（N
‑
acetyl muramide glycanhydrolase），催化在肽聚糖中的N
‑
乙酰胞壁酸和N
‑
乙酰
‑
D
‑
葡糖胺残基之间的和在壳糊精中的N
‑
乙酰
‑
D
‑
葡糖胺残基之间的1,4
‑
β
‑
键的水解，使肽聚糖骨架结构断裂后造成细胞壁破裂，最终导致细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等重要作用。
[0003]直接杀菌机制：一般人认为，溶菌酶能切断肽聚糖中N
‑
乙酰葡萄糖胺和N
‑
乙酰胞壁酸之间的β
‑
1,4糖苷键，破坏肽聚糖支架，从而细菌细胞在内部渗透压的作用下胀裂而死亡。非溶菌机制：有报道称溶菌酶并不是直接作用微生物。如Brooks等（1991）提出一种观点，溶菌酶在正常生理渗透压平衡下溶菌酶并不杀灭敏感细菌，其发挥作用是在微生物被其它物质如卵清蛋白或昆虫血淋巴中多肽（Boman, H . G. ,1991），或动物血清中的补体（Flescher,E.,1991）杀死后，参与去除细胞壁的作用。Hisham R.等（1996）首次提供了一些遗传证据，即：溶菌酶的抗菌活性依赖于其胞壁质酶活性，抗菌活性是由于其结构因素所致。
[0004]溶菌酶作为高等有机体组织及体液中最强大的抗菌剂之一，是生物机体对抗外源病原菌侵袭的重要防御因子，广泛存在于人和动物的多种组织、分泌液如眼泪、唾液中，某些植物、微生物中也广泛存在。根据其来源的不同，可以分为c型溶菌酶，g型溶菌酶，i型溶菌酶，植物源溶菌酶，微生物源溶菌酶和噬菌体溶菌酶；根据其结构可将溶菌酶分类为五种不同的糖苷水解酶（GH）家族：母鸡蛋白溶菌酶（GH22），鹅蛋白溶菌酶（GH23），噬菌体T4溶菌酶（GH24），鞘氨醇单胞菌鞭毛蛋白（GH73）以及Chalaropsis溶菌酶（GH25）。
[0005]溶菌酶是生物体内重要的非特异性免疫因子，其作为一种天然蛋白质，能在胃肠道内作用于营养物质被消化和吸收，对人体无毒性，也不会在体内残留，是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。溶菌酶可用于各种加工食品或饮料制作中，集药理、保健和防腐三种功能于一体。
[0006]与其它抗菌因子相比，溶菌酶具有活性稳定、抗菌谱广、安全性高等优点，因此可广泛应用于食品、医药、饲料和科研等领域。在食品领域，溶菌酶可用作高安全性的食品防腐剂，具有一定的保健作用，可以选择性地、有目的地杀灭微生物而不作用于食物中的其他物质，保证食品原有营养成分不受损失；在乳制品中用作添加因子对肠道中腐败性微生物有特殊的杀灭作用，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增值，是婴儿食品中的抗菌蛋白；在食品软包装中将溶菌酶固定化在食品包装材料上，生产出有抗拒功效的食品包装材料，以达到抗菌保鲜功能。在医药领域，溶菌酶能够参与粘多糖代谢，可作为对抗微生物
NO.1所示。
[0013]进一步的，上述重组溶菌酶具有如下理化性质：
①
发酵产品水平可达到461700U/mL，比活力为24300U/mg；
②
最适pH为5.5
‑
7.5，其中最高点为7.0；
③
最适反应温度为30
‑
65℃，其中最高点为60℃；
④
在50
‑
75℃下处理3min后，重组溶菌酶的残余酶活力均能维持在90%以上；在80
‑
85℃下处理3min后，重组溶菌酶的残余酶活力均能维持在70%以上；在90℃下处理3min后，重组溶菌酶的残余酶活力均能维持在57.9%；
⑤
在pH2.0下处理1hr，重组溶菌酶仍能保持73.3%以上残余酶活力；在pH3.0
‑
8.0下处理1hr，重组溶菌酶均能保持90%以上的残余酶活力；在pH9.0下处理1hr，重组溶菌酶仍能保持73.5%的残余酶活力；
⑥
胰蛋白酶或胃蛋白酶分别处理2hr后，均仍有90%以上的残余酶活力。
[0014]本专利技术还提供了一种高效重组表达载体，所述重组表达载体携带上述的编码基因。
[0015]本专利技术还提供了一种重组基因工程菌株，所述重组基因工程菌株包含上述的重组表达载体，所述重组基因工程菌株以毕氏酵母GS115为宿主细胞。
[0016]本专利技术还提供了上述一种重组溶菌酶的制备方法，包括以下步骤：1）从海科贝特氏菌（Cobetia marina）中提取基因组DNA；2）以提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增获得PCR扩增产物；3）PCR扩增产物用限制性内切酶EcoR I和Not I进行分步酶切，然后与经同样酶酶切的pPIC9k表达载体相连接形成重组表达质粒；4）将重组表达质粒转化至大肠杆菌DH5α中，扩大培养，然后从大肠杆菌DH5α抽提重组表达质粒；5）将抽提的重组表达质粒用限制性内切酶Bgl II 进行线性化，电击转化至毕氏酵母GS115感受态细胞，经培养后筛选获得重组菌株；6）重组菌株经发酵培养表达溶菌酶基因，收获表达产物重组溶菌酶。
[0017]本专利技术还提供了上述一种重组溶菌酶在制备饲料添加剂、食品添加剂中的应用。
[0018]本专利技术的有益效果如下：本专利技术获得了一种新的溶菌酶编码基因，并实现了其在毕氏酵母菌株中的高效重组表达，本专利技术还通过酶学性质检验对所述重组溶菌酶的最适作用温度、最适作用pH值、pH稳定性、热稳定性及比活力进行了分析，结果证明本专利技术的重组溶菌酶具有很好的pH稳定性、良好的热稳定性以及抗蛋白酶水解能力，能够很好的满足和适应食品、医药和饲料行业对该产品的应用要求。
附图说明
[0019]图1：海科贝特氏菌（Cobetia marina）溶菌酶基因电泳图；泳道M为Marker，泳道1为克隆的溶菌酶的DNA。
[0020]图2：重组溶菌酶质粒LY/pPIC9k酶切后电泳图；泳道M为Maker，泳道1为酶切后重组质粒。
[0021]图3：重组毕氏酵母溶菌酶发酵液电泳图；泳道M为Maker，泳道1和2均为重组毕氏酵母溶菌酶的发酵取样。
[0022]图4：重组溶菌酶最适反应温度分析。
[0023]图5：重组溶菌酶温度耐受性分析。
[0024]图6：重组溶菌酶最适反应pH分析。
[0025]图7：重组溶菌酶pH耐受性分析。
[0026]图8：本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种来源于海科贝特氏菌（Cobetia marina）的重组溶菌酶，其特征在于：所述重组溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的重组溶菌酶，其特征在于：所述重组溶菌酶的编码基因的核苷酸序列如如SEQ ID NO.1所示。3.根据权利要求1所述的重组溶菌酶，其特征在于：所述重组溶菌酶的理化性质为：
①
发酵产品水平可达到461700U/mL，比活力为24300U/mg；
②
最适pH为5.5
‑
7.5，其中最高点为7.0；
③
最适反应温度为30
‑
65℃，其中最高点为60℃；
④
在50
‑
75℃下处理3min后，重组溶菌酶的残余酶活力均能维持在90%以上；在80
‑
85℃下处理3min后，重组溶菌酶的残余酶活力均能维持在70%以上；在90℃下处理3min后，重组溶菌酶的残余酶活力均能维持在57.9%；
⑤
在pH2.0下处理1hr，重组溶菌酶仍能保持73.3%以上残余酶活力；在pH3.0
‑
8.0下处理1hr，重组溶菌酶均能保持90%以上的残余酶活力...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶秀云，靳伟刚，李仁宽，应喜娟，
申请(专利权)人：福建福大百特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：