一种微泡菌超氧化物歧化酶及其编码基因制造技术

本发明专利技术属于生物化学技术领域，具体涉及一种微泡菌超氧化物歧化酶SOD及其编码基因。所述超氧化物歧化酶SOD具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其编码基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。生产所述超氧化物歧化酶SOD的方法包括以下步骤：在适合于所述超氧化物歧化酶SOD生产的条件下，对携带有上述能表达超氧化物歧化酶SOD的培养物进行发酵，收获表达产物，得到超氧化物歧化酶SOD。本发明专利技术所获得的超氧化物歧化酶具有良好的酶学性质，可以应用于制备饲料添加剂、食品添加剂。食品添加剂。

【技术实现步骤摘要】
一种微泡菌超氧化物歧化酶及其编码基因


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种微泡菌（Microbulbifer sp.）超氧化物歧化酶SOD及其编码基因。

技术介绍

[0002]超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD，EC 1.15.1.1）是一类广泛存在于生物体内，催化超氧阴离子自由基（O2‑
）发生歧化反应的一类金属酶。1938年Mann和Keilin首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质（Hemocuprein），1969年McCord及Fridovich发现该蛋白有催化O2‑
，发生歧化反应的功能，故将此酶命名为超氧化物歧化酶。
[0003]机体物质和能量代谢会产生一些有毒的副产物，例如超氧离子自由基(O2‑
)。机体内O2‑
形成分为生理性和病理性两方面。正常生理过程的O2‑
主要来源于呼吸链中电子传递过程。多种疾病的发病过程中也会产生大量O2‑
。生物体内过量的O2‑
存在能够直接或间接地引起生物分子的氧化破坏，诱发脂质过氧化,降低膜脂质流动性,是导致许多疾病产生的主要原因。机体存在应对超氧离子自由基的一套机制，主要包括超氧化物歧化酶SOD，它可以将O2‑
歧化为H2O2和O2，而过氧化氢酶等可催化过氧化氢分解，最终清除超氧离子自由基。SOD专一性清除超氧离子自由基，催化反应：2H++O2‑
→
H2O2+O2。国内外研究表明，SOD对多种因O2‑
诱发的有关疾病具有良好的疗效，并且是一种很有希望的抗衰老剂。
[0004]按照SOD中金属辅基的不同，大致可将其分为以下三类：第一类是CuZnSOD，主要存在于真核细胞的细胞质中。第二类是含有Fe
‑
、Mn
‑
或者二者都有的Fe/Mn SOD，FeSOD主要存在于原核细胞和真核细胞的基质中，MnSOD主要存在于原核细胞体，真核细胞的细胞浆和线粒体内。第三类是NiSOD，主要是在土壤链霉菌和藻青菌中发现的。
[0005]SOD几乎存在于所有的生物中，不同种SOD在生物中以及生物的组织亚细胞定位不同。很多革兰氏阴性致病菌中存在细胞质Cu/ZnSOD。目前在原生生物中未发现Cu/ZnSOD。酵母中存在细胞质和线粒体Cu/ZnSOD。植物中的Cu/ZnSOD主要位于细胞质和叶绿体中，在过氧化物酶体中也有分布。动物细胞中的Cu/ZnSOD位于胞质中。在血吸虫中，还发现了胞外Cu/ZnSOD。另外胞质Cu/ZnSOD也出现在细胞核，线粒体间隙和过氧化物酶体中。MnSOD和FeSOD非常相似，通常认为起源于相同的祖先。需氧和厌氧细菌及需氧和兼性厌氧的古核生物中均存在FeSOD。甚至在严格厌氧的产甲烷菌中也发现了FeSOD。原生动物内变形虫、锥体虫、疟原虫和帕金虫中也发现有FeSOD。需氧细菌中存在MnSOD并且它的表达量在氧气存在的情况下发生上调。蓝细菌中包含一种独特的膜结合MnSOD。一些古生菌中包含Mn/FeSOD，即结合任意一种金属离子均有活性，但是在需氧的条件下大多结合Mn而在厌氧的条件下则结合Fe。在眼虫属的原生动物中发现了与类囊体膜紧密结合的MnSOD。许多真菌中也有MnSOD的存在。植物中的 MnSOD位于线粒体中和过氧化物酶体中。通常情况下动物中的MnSOD位于线粒体中。Youn等在链霉菌中首次发现了NiSOD。Schmidt和Eitinger也分别在放线菌和蓝细菌中发现了与NiSOD高度相似的基因。但是，在革兰氏阳性细菌、古生菌和真核生物中还没有发现NiSOD。
[0006]Cu/ZnSOD是相对分子质量在32kDa左右的同源二聚体，每个单体是由八股反平行的β折叠形成的β桶结构。Cu和Zn离子通过两个环结合在β桶的外侧。金属的结合位点在该酶中是保守的。牛红细胞中Cu
2+
与 44、46 、61和118位的组氨酸相连，Zn
2+
与61、69、78 位的组氨酸和81位的天冬氨酸相连。Cu、Zn之间通过61位组氨酸形成“咪唑桥”结构。Cu
2+
与酶的活性直接相关，而Zn
2+
则与酶的稳定性有关。组成FeSOD和MnSOD的每个单体的分子质量约为20kDa，大多数原核生物的 FeSOD和MnSOD是同源二聚体，而植物等真核生物的FeSOD和MnSOD是同源四聚体。每个单体包含由α螺旋组成的N末端结构域以及由α螺旋和三个β折叠组成C末端结构域。金属结合位点就在这两个结构域之间。每个单体含一个Fe离子或Mn离子，它与三个组氨酸，一个天冬氨酸及一个H2O或羟基配体配位。NiSOD是由四个α螺旋组成的同源四聚体，相对分子质量约为80kDa。每个α螺旋在N
‑
末端结合一个Ni离子。此位置包含His
‑ꢀ
Cys
‑
X
‑
X
‑
Pro
‑
Cys
‑
Gly
‑
X
‑
Tyr模体结构。该模体结构不仅对金属的结合至关重要，而且在酶的催化作用中发挥重要作用。因此，它也是判断NiSOD的标志。
[0007]SOD作为生物体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体内的超氧阴离子自由基，从而避免机体内自由基浓度过高时引起的不良反应，在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，受到国内外学者和研究者的广泛关注，其研究领域已涉及到化学、生物学、医学、食品科学和畜牧兽医学等多个学科。SOD在食品工业主要应用四方面：1）作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，添加到各种食品中；2）制成多种剂型的SOD或复合型食品；3）用作食品的天然抗氧化剂；4）以富含SOD的原料加工制成保健食品。此外，SOD添加于化妆品中可起到防晒，防止脂褐素的形成，防治皮肤病以及防治瘢痕形成等作用。
[0008]SOD的生产方式主要有以下四种:
①
利用动物血液提取法；
②
从植物中提取；
③
选用高产菌株进行微生物发酵法生产；
④
基因工程法获得。目前市场上的SOD产品大部分是从动物血液中提取的。由于原材料有限、纯化困难等原因，导致SOD的纯度低、产量少，生产动物源血液制品的风险加大，此外，对产品纯度要求的增高也增加了生产成本。天然微生物和植物来源的SOD也因其种类少、表达量低、酶分子量大、与动物及人体内SOD的同源性低，从而也难以得到广泛的应用。因此，寻找优质的动物来源的SOD外源基因，对其进行合理的改造，构建廉价、高效的表达系统，是突破传统制备方法的有效途径之一。
[0009]本专利技术从海洋细菌Microbulbifer sp.stain BN3（微泡菌）中克隆获得一个新的超氧化物歧化酶基因，实现了其在毕氏酵母菌株中的高水平表达；该重组超氧化物歧化酶具有广泛的温度适用范围和pH适用范围，及良好的温度耐受性、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种超氧化物歧化酶SOD，其特征在于：所述超氧化物歧化酶SOD来源于微泡菌（Microbulbifer sp.）BN3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的超氧化物歧化酶SOD，其特征在于：所述超氧化物歧化酶SOD具有如下特征：
①
发酵产品水平可达到28500U/mL，比活力为2300U/mg；
②
最适pH为6.0
‑
7.5，其中最高点为7.0；
③
最适反应温度为20
‑
40℃，其中最高点为30℃；
④
在60
‑
80℃下分别处理5min后，均仍能保持80%以上的残余酶活力；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶秀云，靳伟刚，李仁宽，应喜娟，
申请(专利权)人：福建福大百特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：