儿茶酚1,2-双加氧酶及其编码基团、制备方法和应用技术

本发明专利技术适用于生物技术领域，提供了一种儿茶酚1,2

【技术实现步骤摘要】
儿茶酚1,2
‑
双加氧酶及其编码基团、制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种儿茶酚1,2
‑
双加氧酶及其编码基团、制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着原油及其加工品使用量的增加，常规油气资源的不断消耗，重油在我国工业中所占的比例日益增大，而由重油导致的环境污染事件也呈逐年加重的态势。微生物修复技术因具有绿色、高效、经济、无二次污染等优势，被视为重油污染治理的理想技术手段。由于重油中富含难生物降解的高毒性多环芳烃组分，限制了微生物修复技术在重油污染修复中的应用。因此，如何高效去除重油中的多环芳烃组分是提高重油污染微生物修复效率的关键。
[0003]酶修复因具有可专一性高效降解某类污染物，且降解过程不受跨膜运输的限制，对环境营养要求不高、不易受捕食和有毒物质影响等优势，已被用于环境污染治理，因此，利用特定的酶来降解重油中的多环芳烃组分对提高重油污染物的微生物修复效率至关重要。多环芳烃生物降解的关键限速步骤是苯环的起始加氧反应和苯环的最终开环反应，利用催化氧化上述反应的酶直接降解重油中的多环芳烃组分均可提高重油的微生物降解速率。因此，开发能够高效催化苯环彻底开环的儿茶酚1,2
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双加氧酶具有重要的意义。
[0004]儿茶酚1,2
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双加氧酶是内二元醇双加氧酶，它通过将氧分子的两个氧原子插入到底物的两个碳原子上，引起苯环结构不稳定而开环，进而生成顺，顺
‑
黏糠酸。儿茶酚1,2
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双加氧酶是邻位氧化开环酶，它催化儿茶酚的邻位降解。然而，由于野生菌株的蛋白表达过程受到多种因素的调控，产酶量往往难以达到较高的水平，限制了酶制剂在污染修复领域中的应用限制。因此，利用基因工程技术克隆儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因，并使这些基因在异源受体上大量表达具有重要意义。

技术实现思路

[0005]本专利技术实施例的目的在于提供一种儿茶酚1,2
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双加氧酶，旨在解决
技术介绍
中提出的问题。
[0006]本专利技术实施例是这样实现的，一种儿茶酚1,2
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双加氧酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术实施例的另一目的在于提供一种儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
[0008]本专利技术实施例的另一目的在于提供一种上述的儿茶酚1,2
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双加氧酶的制备方法，其包括以下步骤：
[0009]特异性扩增所述儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因，得到扩增产物；
[0010]将扩增产物进行双酶切后，再连接到同样经双酶切的克隆质粒上，得到重组克隆质粒；
[0011]将重组克隆质粒电转移到第一菌株上，并经筛选，得到克隆菌株；
[0012]从克隆菌株中提取重组克隆质粒，并对重组克隆质粒和表达质粒进行双酶切处理后，再将二者的酶切产区连接，得到重组表达质粒；
[0013]将重组表达质粒电转化到第二菌株上，并经筛选，得到表达菌株；
[0014]将表达菌株进行诱导表达培养，得到所述儿茶酚1,2
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双加氧酶。
[0015]作为本专利技术实施例的一个优选方案，所述特异性扩增所述儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因，得到扩增产物的步骤，具体包括：
[0016]以节杆菌Arthrobacter sp.Z5T的基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，得到扩增产物。
[0017]作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因如序列表SEQ ID NO.1所示。
[0018]作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述特异性引物携带限制性酶切位点EcoR I和Hind III，其包括：
[0019]上游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；
[0020]下游引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示。
[0021]作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述克隆质粒为pMD19T
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Arcat，所述第一菌株为E.coli DH5α，所述表达质粒为pET28a，所述第二菌株为E.coli B L21(DE3)。
[0022]作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述将表达菌株进行诱导表达培养，得到所述儿茶酚1,2
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双加氧酶的步骤，具体包括：
[0023]将表达菌株划线到LB
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Kan平板上进行培养后，挑取单菌落于液体LB
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Kan中进行培养，得到培养液；
[0024]将培养液接种于LB培养液中继续进行培养至预设的OD600值后，再加入诱导剂进行诱导表达，收集得到菌体；
[0025]往菌体中加入细胞裂解液，并置于冰上进行超声波破碎至菌液澄清时结束，得到含有所述儿茶酚1,2
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双加氧酶的粗酶液。
[0026]作为本专利技术实施例的另一个优选方案，所述步骤中，预设的OD
600
值为0.4～0.8。
[0027]本专利技术实施例的另一目的在于提供一种含上述儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因的克隆载体。
[0028]进一步地，一种含上述儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因的克隆载体为将编码儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因片段连接至克隆质粒pMD19T上，得到重组克隆质粒pMD19T
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Arcat。
[0029]本专利技术实施例的另一目的在于提供一种含有儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因的克隆菌株。
[0030]进一步地，将重组克隆质粒电转移到克隆菌株E.coli DH5α中，通过LB
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Amp平板蓝白斑筛选获得携带有pMD19T
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Arcat的克隆菌株E.coli DH5α。
[0031]本专利技术实施例的另一目的在于提供一种含有儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因的表达载体。
[0032]进一步地，一种含有儿茶酚1,2
‑
双加氧酶的编码基因的表达载体为将编码儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因片段连接至表达质粒pET28a上，得到重组表达质粒pET28a
‑
Arcat。
[0033]本专利技术实施例的另一目的在于提供一种含有儿茶酚1,2
‑
双加氧酶的编码基因的表达菌株。
[0034]进一步地，将重组表达质粒电转移到表达菌株E.coliBL21(DE3)中，通过LB
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Kan平板筛选获得儿茶酚1,2
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双加氧酶表达质粒pET28a
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.儿茶酚1,2
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双加氧酶，其特征在于，所述儿茶酚1,2
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双加氧酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。2.如权利要求1所述的儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的儿茶酚1,2
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双加氧酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：特异性扩增所述儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因，得到扩增产物；将扩增产物进行双酶切后，再连接到同样经双酶切的克隆质粒上，得到重组克隆质粒；将重组克隆质粒电转移到第一菌株上，并经筛选，得到克隆菌株；从克隆菌株中提取重组克隆质粒，并对重组克隆质粒和表达质粒进行双酶切处理后，再将二者的酶切产区连接，得到重组表达质粒；将重组表达质粒电转化到第二菌株上，并经筛选，得到表达菌株；将表达菌株进行诱导表达培养，得到所述儿茶酚1,2
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双加氧酶。4.根据权利要求3所述的儿茶酚1,2
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双加氧酶的制备方法，其特征在于，所述特异性扩增所述儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因，得到扩增产物的步骤，具体包括：以节杆菌Arthrobacter sp.Z5T的基因组DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，得到扩增产物。5.根据权利要求3或4所述的儿茶酚1,2
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双加氧酶的制备方法，其特征在于，所述儿茶酚1,2
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双加氧酶的编码基因如序列表SEQ ID NO.1所示。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：代小丽，吕静，
申请(专利权)人：中国石油大学北京，
类型：发明
国别省市：