硫醚单加氧酶突变体及其在制备手性拉唑药物中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及一种硫醚单加氧酶突变体；编码所述硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体；以及所述重组硫醚单加氧酶突变体在制备手性拉唑药物中的应用。与其他制备光学纯拉唑类药物的生物催化剂相比，本发明专利技术提供的硫醚单加氧酶突变体具有催化活性高、底物特异性强、热稳定性好、催化底物范围广、立体选择性高的优点，在工业应用中显示出广泛的应用前景。显示出广泛的应用前景。显示出广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
硫醚单加氧酶突变体及其在制备手性拉唑药物中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，尤其是涉及一种硫醚单加氧酶突变体，编码所述硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，突变体酶制剂的制备，以及突变体酶制剂在制备手性拉唑药物中的应用。

技术介绍

[0002]质子泵抑制剂(Proton pump inhibitors，PPIs)是一类广泛用于治疗胃酸性消化疾病的首选药物。PPIs药物主要有1988年在瑞典上市的奥美拉唑、1995年在日本上市的兰索拉唑、1997年在德国上市的泮托拉唑以及1999年在美国上市的雷贝拉唑等，这些药物最初都以外消旋体的形式上市，在药物市场上占有举足轻重的地位。到了2001年，第一个手性PPI艾司奥美拉唑(奥美拉唑的左旋异构体)在美国重磅上市，之后持续多年占据全球药物销量前十位。2009年，右兰索拉唑被美国FDA批准上市，这也是继艾司奥美拉唑的第二个手性PPI。通常，与外消旋的PPIs相比，手性PPIs具有更强的抑酸强度，更长的抑酸时间以及更高的生物利用度。因此，手性PPIs正逐渐成为治疗胃酸性消化疾病的特效药物。
[0003]虽然目前手性PPIs在工业上均以化学法合成，但是化学法合成中普遍存的手性催化剂昂贵、立体选择性差等问题还无法避免；化学法合成中使用的大量过氧酸、H2O2、有机催化剂和有机溶剂等物质会对工作人员的身心健康及人类生活环境造成严重的伤害；化学反应条件相对苛刻，对生产设备的要求也很高，生产投入成本也随之增加。为响应绿色生活、绿色制造的时代号召，具有催化选择性好、反应条件温和、反应体系绿色环保等优点的生物合成法逐渐成为化学合成法的有益补充。
[0004]目前PPIs的生物法合成途径中主要以前手性硫醚为底物，利用整细胞、游离酶等作为催化剂催化其不对称氧化，得到光学纯的PPIs。目前已报道的可以用于PPIs合成的生物催化剂主要有：1)霉菌Cunninghamella echinulata MK40，可以催化7.5mM雷贝拉唑硫醚转化，反应144小时后转化率为92％，产物为(S)
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雷贝拉唑，而以奥美拉唑硫醚和兰索拉唑硫醚作为底物时，转化率分别仅为45％和0.6％；2)赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sp.B71生长细胞，可以催化0.1g/L奥美拉唑硫醚和泮托拉唑硫醚生成埃索美拉唑，但转化率分别仅为70％和8％，对测试的艾普拉唑硫醚和兰索拉唑硫醚均无催化活性；3)来自Acinetobacter calcoaceticus的环己酮单加氧酶突变体，可以催化15mM奥美拉唑不对称氧化，生成艾司奥美拉唑(99％ee)；4)专利WO2011/071982中公开的由美国Codexis公司通过定向进化改造来源于Acinetobacter calcoaceticus NCIMB 9871的环己酮单加氧酶突变体可以高效催化奥美拉唑硫醚合成艾司奥美拉唑，但对兰索拉唑活力非常低，且立体选择性较差；5)专利CN 112725297 A公开了来自Cupriavidus basilensis的硫醚单加氧酶CbSMO，对所测的14种拉唑硫醚化合物均有氧化活力，其可催化10mM兰索拉唑硫醚的不对称氧化，生成右旋兰索拉唑(99％ee)。与CbSMO的母本相比，突变体CbSMO
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虽然具有更高的催化活力及热稳定性，但仍难满足工业生产的需求。
[0005]虽然目前已有的生物催化剂可以催化包括兰索拉唑硫醚在内的底物氧化，但是其
氧化活性普遍较低、热稳定性差、底物特异性较差(产物亚砜会被进一步氧化生成副产物砜)、底物上载量低等问题，很难满足工业生产的要求。

技术实现思路

[0006]针对生物法合成手性亚砜药物右旋兰索拉唑亚砜存在的生物催化剂催化活性低、热稳定性差、底物特异性差及底物上载量低等问题，本专利技术选择专利CN 112725297 A中对兰索拉唑硫醚具有较高活性的CbSMO
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(即专利CN 112725297 A中SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中第266位的氨基酸Gly替换为Asp，第313位的氨基酸Leu替换为Pro)作为目标，通过蛋白质工程的手段对其进行进一步的分子改造，提供一种对兰索拉唑硫醚催化活性、底物特异性及热稳定性显著提升的硫醚单加氧酶突变体，编码所述硫醚单加氧酶突变体的核酸，含有该核酸的重组表达载体，含有该重组表达载体的重组表达转化体，重组硫醚单加氧酶突变体催化剂，以及重组硫醚单加氧酶催化剂在制备手性拉唑药物中的应用。
[0007]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0008]技术方案之一，本专利技术提供对兰索拉唑硫醚催化活性、底物特异性及热稳定性显著提升的硫醚单加氧酶突变体。以氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的(WT)，通过随机突变及半理性设计的方法，结合酶标仪高通量初筛和进一步摇瓶复筛，鉴别获得多个对兰索拉唑硫醚催化活性、底物特异性及热稳定性显著提升的硫醚单加氧酶突变体。
[0009]本专利技术提供的硫醚单加氧酶突变体，为将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中的第98位Asp、第252位Gly、第253位Met、第256位Arg、第269位Phe、第272位Leu、第316位Val、第485位Leu、第486位Met、第487位Ala、第488位Leu中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质；所述衍生蛋白质对兰索拉唑硫醚的氧化活性显著提升，在底物特异性方面也有所提高。
[0010]优选地，硫醚单加氧酶突变体的氨基酸序列为如下中的一种：
[0011](1)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸Asp替换为Met；
[0012](2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸Asp替换为Gly；
[0013](3)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸Gly替换为Met；
[0014](4)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸Gly替换为Pro；
[0015](5)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸Met替换为Val；
[0016](6)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸Met替换为Pro；
[0017](7)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸Met替换为Gln；
[0018](8)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸Arg替换为Met；
[0019](9)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸Arg替换为Thr；
[0020](10)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸Arg替换为Trp；
[0021](11)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第269位氨基酸Phe替换为His；
[0022本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种硫醚单加氧酶突变体，其特征在于，为将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中的第98位Asp、第252位Gly、第253位Met、第256位Arg、第269位Phe、第272位Leu、第316位Val、第485位Leu、第486位Met、第487位Ala、第488位Leu中的一个或多个氨基酸残基替换为其他氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质；优选地，硫醚单加氧酶突变体的氨基酸序列为如下中的一种：(1)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸Asp替换为Met；(2)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸Asp替换为Gly；(3)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸Gly替换为Met；(4)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第252位氨基酸Gly替换为Pro；(5)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸Met替换为Val；(6)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸Met替换为Pro；(7)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸Met替换为Gln；(8)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸Arg替换为Met；(9)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸Arg替换为Thr；(10)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸Arg替换为Trp；(11)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第269位氨基酸Phe替换为His；(12)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第269位氨基酸Phe替换为Ser；(13)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第272位氨基酸Leu替换为Lys；(14)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第272位氨基酸Leu替换为Glu；(15)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第316位氨基酸Val替换为Ala；(16)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第316位氨基酸Val替换为Asp；(17)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第485位氨基酸Leu替换为Phe；(18)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第485位氨基酸Leu替换为Trp；(19)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第486位氨基酸Met替换为Leu；(20)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第487位氨基酸Ala替换为Asp；(21)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第487位氨基酸Ala替换为Glu；(22)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第488位氨基酸Leu替换为Thr；(23)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸Met替换为Gln；第269位氨基酸Phe替换为Ser；第316位氨基酸Val替换为Asp；(24)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第256位氨基酸Arg替换为Thr；第487位氨基酸Ala替换为Glu；第488位氨基酸Leu替换为Thr；(25)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸Met替换为Gln；第269位氨基酸Phe替换为Ser；第485位氨基酸Leu替换为Phe；第488位氨基酸Leu替换为Thr；(26)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸Met替换为Gln；第269位氨基酸Phe替换为Ser；第316位氨基酸Val替换为Asp；第488位氨基酸Leu替换为Thr；(27)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第98位氨基酸Asp替换为Gly；第253位氨基酸Met替换为Gln；第269位氨基酸Phe替换为Ser；第316位氨基酸Val替换为Ala；(28)SEQ ID No.2所示氨基酸序列中第253位氨基酸Met替换为Gln；第256位氨基酸Arg替换为Met；第485位氨基酸Leu替换为Phe；第487位氨基酸Ala替换为Glu；第488位氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：郁惠蕾，刘峰，许建和，潘江，耿强，赵晨，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：