本发明专利技术提供了一种调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白及其制备方法，所述硫氧还蛋白的序列表如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。所述硫氧还蛋白为含有序列表SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的真核重组表达质粒pETrx转化大肠杆菌DH5α获得的重组蛋白。通过用上述序列表的硫氧还蛋白能够有效提升花粉在柱头表面的水合和萌发以及花粉管在柱头表面的生长。此外，本申请还提供了一种调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白的制备方法，该方法能够精确的制得硫氧还蛋白，方便硫氧还蛋白的使用。方便硫氧还蛋白的使用。
Thioredoxin regulating the recognition of plant pollen tube and stigma and its preparation method
【技术实现步骤摘要】
ID No.2所示硫氧还蛋白的插入突变体基因为nrta
‑
1。
[0018]进一步的，gr1
‑
1插入到GR1的第三个内含子序列中，ntra
‑
1插入到NTRA的第1个外显子序列中。
[0019]进一步的，GR1的基因序列表如SEQ ID No.3所示；NTRA的基因序列表如SEQ ID No.4所示；
[0020]根据本专利技术实施例的第二方面，提供一种硫氧还蛋白于调控植物花粉管与柱头识别中的应用。
[0021]本专利技术实施例具有如下优点：本专利技术实施例提供一种调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白及其制备方法，所述硫氧还蛋白的序列表如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。所述硫氧还蛋白为含有序列表SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的真核重组表达质粒pETrx转化大肠杆菌DH5α获得的重组蛋白。通过用上述序列表的硫氧还蛋白能够有效提升花粉在柱头表面的水合和萌发以及花粉管在柱头表面的生长。
具体实施方式
[0022]下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]实施例1
[0024]本实施例提供一种调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白，所述硫氧还蛋白的序列表如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。进一步的，所述硫氧还蛋白为含有序列表SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的真核重组表达质粒pETrx转化大肠杆菌DH5α获得的重组蛋白。
[0025]实施例2
[0026]本实施例提供一种调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白的制备方法，包括以下步骤：
[0027]①
用正向引物和反向引物进行PCR扩增cDNA，PCR产物纯化后与载体pBS T连接，连接混合液转化大肠杆菌，得质粒pBSTrx；其中，以拟南芥cDNA为模板。
[0028]②
将质粒pBSTrx和质粒pET259用限制性内切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，得质粒pETrx；
[0029]③
将质粒pETrx转化BL21(DE3)，所得转化子BL21(DE3)/pETrx纯化所得重组蛋白，制得氨基酸序列表如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的硫氧还蛋白；
[0030]所述正向引物的序列如SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示；
[0031]所述反向引物的序列如SEQ ID No.7或SEQ ID No.8所示。
[0032]进一步的，制备SEQ ID No.1所示硫氧还蛋白的插入突变体基因为gr1
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1，制备SEQ ID No.2所示硫氧还蛋白的插入突变体基因为nrta
‑
1。
[0033]进一步的，gr1
‑
1插入到GR1的第三个内含子序列中，ntra
‑
1插入到NTRA的第1个外显子序列中。
[0034]进一步的，GR1的基因序列表如SEQ ID No.3所示；NTRA的基因序列表如SEQ ID No.4所示；
[0035]根据本专利技术实施例的第二方面，提供一种硫氧还蛋白于调控植物花粉管与柱头识别中的应用。
[0036]实验一
[0037]为实现本申请技术方案的有效实施，申请人进行了以下实验，具体请参阅以下内容：
[0038]1)拟南芥gr1 ntra突变体的鉴定；
[0039]GR1基因的基因组序列包括16个外显子和15个内含子，NTRA基因的基因组序列包括2个外显子和1个内含子。从拟南芥T
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DNA插入突变体库ABRC分别购买了这两个基因的T
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DNA插入突变体，并分别命名为gr1
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1和nrta
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1。gr1
‑
1插入到GR1的第三个内含子序列中，ntra
‑
1插入到NTRA的第1个外显子序列中。
[0040]通过qRT
‑
PCR分析发现，GR1和NTRA分别在gr1和ntra突变体中表达水平明显降低。
[0041](2)gr1 ntra双突变的雄配子传递异常；
[0042]研究表明gr1和ntra单突变体没有表型，gr1 ntra ntrb导致不育，但是NTRB不在花粉中表达。从拟南芥突变体库购买了文章中用过的相关突变体进行验证，利用基因特异引物和T
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DNA引物，通过PCR的方法鉴定发现：gr1/+雄配子传递效率降低(回交后代野生型和杂合体比例为60:32，大于理论值1:1)，这可能是由于花粉数远大于胚珠数，使正常花粉完全可以使所有胚珠完成双受精，造成gr1/+没有表型；ntra/+雄配子传递效率正常(回交后代野生型和杂合体比例接近于1:1)；ntra/+ntrb/
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和ntra/
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ntrb/+中雄配子传递效率也接近正常(回交后代野生型和杂合体的比例接近1:1)；而gr1/+ntra/
‑
或gr1/
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ntra/+自交结果显示其后代植株中没有双纯合突变体，野生型与杂合体的分离比接近1:1，这表明gr1 ntra的配子体是有缺陷的；为了研究gr1/+ntra/
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和gr1/
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ntra/+造成雄配子传递缺陷的原因，分别用这两种突变体与野生型进行了回交实验，发现当用杂合体做父本时gr1 ntra的传递效率为0，而杂合体做母本时其传递效率正常，这表明gr1 ntra双突变体的雄配子传递效率丧失。
[0043](3)GR1和NTRA突变不影响花粉形态、细胞核发育和花粉活力；
[0044]为了确定gr1 ntra突变体中雄配子的功能障碍是否是由于花粉发育异常造成的，首先对野生型和突变体的花粉进行了扫描电镜的观察，结果发现，gr1/
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、ntra/
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、gr1/+ntra/
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和gr1/
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ntra/+的花粉外形与野生型相比没有异常；DAPI染色观察发现在gr1/
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、ntra/
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、gr1/+ntra/
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和gr1/
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ntra/+的花粉与野生型一样都包含两个生殖核和一个营养核，即突变体的花粉发育正常；亚历山大染色发现，gr1/
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、ntra/
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、gr1/+ntra/
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和gr1/
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ntra/+的花粉染色与野生型相似，表明突变体花粉活力正常。
[0045](4)gr1 ntra花粉水合和体外本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白，其特征在于，所述硫氧还蛋白的序列表如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。2.根据权利要求1所述调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白，其特征在于，所述硫氧还蛋白为含有序列表SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的真核重组表达质粒pETrx转化大肠杆菌DH5α获得的重组蛋白。3.根据权利要求1或2所述调控植物花粉管与柱头识别的硫氧还蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
①
用引物F1和R1进行PCR扩增cDNA，PCR产物纯化后与载体pBS T连接，连接混合液转化大肠杆菌，得质粒pBSTrx；
②
将质粒pBSTrx和质粒pET259用限制性内切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4 DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌，得质粒pETrx；
③
将质粒pETrx转化BL21(DE3)，所得转化子BL21(D...
【专利技术属性】
技术研发人员：代新仁，孟文静，高新起，李全梓，朱东姿，
申请(专利权)人：中国林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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