一种氧化酶及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物生物技术、污水处理技术和基因工程技术领域。本发明专利技术公开的氧化酶是具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：1)序列表SEQ ID No.1中的所示氨基酸序列；2)将序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有氧化酶功能的蛋白质。本发明专利技术的羟胺还原酶能以羟胺、巯基乙胺等为底物，将污水中的氨氮转化成氮气，转化率>80％，在羟胺脱毒及含氨氮废水处理中发挥重要作用。作用。作用。

【技术实现步骤摘要】
一种氧化酶及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物生物技术、污水处理技术和基因工程


技术介绍

[0002]氮是促进农业可持续发展的重要元素。从氨到氮气的转化过程是污水脱氮处理的主要机制。目前已知氨到氮气转化主要有四种途径，包括：1)好氧硝化
‑
厌氧反硝化，是最广为人知的经典脱氮途径；2)短程硝化
‑
反硝化，与全程硝化相比不仅降低曝气量从而节省能量消耗，也可以减少反硝化过程有机物消耗从而降低运行成本；3)厌氧氨氧化，可以以亚硝酸盐为电子受体，把氨氮直接转化成氮气；4)异氧硝化
‑
好氧反硝化，可在好氧条件下完成脱氮。以上脱氮途径都需要多株菌协同完成或好氧
‑
厌氧条件变换才能完成。如何寻找到一种环境友好和高效的酶，一直是这个领域的研究热点和难点。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供的氧化酶，可在有氧条件下直接将羟胺氧化成氮气，转化效率高，能耗低，几乎不积累温室气体一氧化二氮，氧化酶使高效低能耗的氨到氮气的生物转化成为现实。
[0004]本专利技术的目的是提供一种氧化酶及其编码基因。
[0005]本专利技术所提供的氧化酶，来源于产碱菌(Alcaligenes sp.)HO
‑
1，该菌株已于2018年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏中心登记入册编号CGMCC No.16549，该中心简称为CGMCC，该中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006]第一，本专利技术公开的氧化酶是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质；
[0007]1)具有序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序列，由371个氨基酸残基组成；
[0008]2)将序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有氧化酶功能的蛋白质。
[0009]第二，本专利技术公开的氧化酶基因，具有下述核苷酸序列之一：
[0010]1)序列表中SEQ ID No.2的多核苷酸序列，由954bp碱基对组成；
[0011]2)编码序列表中SEQ ID No.1蛋白质的多核苷酸序列。
[0012]本专利技术的羟胺还原酶能以羟胺、巯基乙胺等为底物，将污水中的氨氮转化成氮气，转化率>80％，在羟胺脱毒及含氨氮废水处理中发挥重要作用。
附图说明
[0013]图1是氧化酶在大肠杆菌中的表达图。
[0014]图2是以羟胺为底物每升酶反应体系氮气
‑
氮的生成量图。
[0015]图3是以硫铵为底物氧化酶系重组大肠杆菌氮气等转化率图。
[0016]图4是以硫铵为底物HO 1菌株的氮气等转化率图。
[0017]图5是以谷氨酰氨为底物HO 1菌株氮气等转化率图。
具体实施方式
[0018]实施例1
[0019]本专利技术的氧化酶及其基因的获得
[0020]产碱菌(Alcaligenes sp.)HO
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1，该菌株已于2018年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏中心登记入册编号CGMCC No.16549，该中心简称为CGMCC，该中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0021]将产碱菌HO
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1菌株在LB平板上的单菌落挑到LB液体培养基中，30℃震荡培养，收集菌体，提取基因组DNA，使用Epicentre公司CopyControl Fosmid Library Production Kit试剂盒构建FOSMID文库。将提取的高质量的基因组DNA，随机剪切成大小均匀的片段(集中在30
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45K)之间，将DNA片段进行平端处理和5'磷酸化，连接到CopyControl pCC1FOS Vector上，经转导至大肠杆菌EPl300
‑
T1
R
宿主细胞中进行37℃培养30分钟，涂布到含12.5μg
·
mL
‑
1氯霉素抗性的固体LB平板上，挑选CopyControl Fosmid阳性单克隆到384孔板上并保存在
‑
80℃冰箱。
[0022]羟胺有705nm处有最大吸收峰，参考引文(Shurong Liu et al.Geoderma 232
‑
234(2014)117
‑
122；)，用比色法以羟胺为反应产物筛选文库，反应绿色为产羟胺的阳性克隆。提取其中一个克隆的质粒测序。对测序结果进行ORF分析，在NCBI上进行Blastx比对，从序列中分析出编码氧化酶的基因序列。
[0023]氧化酶的氨基酸序列与Streptomyces venezuelae(ATCC 10712/CBS 650.69/DSM40230/JCM 4526)的氧化酶同源性为27.9％。该氧化酶的氨基酸序列如序列表中的SEQ No.1，其编码基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ No.2.所示。
[0024]实施例2
[0025]本专利技术新型氧化酶表达载体的构建、在大肠杆菌中的表达
[0026]提取产碱菌HO
‑
1菌株基因组DNA，以基因组DNA为模板，PCR扩增本专利技术的氧化酶基因，氧化酶引物为：正向引物：5
’
gcaaatgggtcgcggatccATGACTATCAAAAGCTACGAAACCG 3
’
和反向引物5
’
tcgagtgcggccgcaagcttTTGCAGCGCCTCCTGTTG 3
’
，横线部分为与质粒重叠序列。
[0027]反应体系为：模板6
‑
10ng/ul；dNTPmix(25mM)8ul,正向引物(10mM)1ul，反向引物(10mM)1ul，10
×
buffer 5ul，FastPfu 0.4ul，ddH2O补至50ul，其中高保真酶和缓冲液购自全式金生物技术公司。PCR条件95℃2min预变性，95℃20sec，55℃30sec，72℃1min，共30个循环；72℃彻底延伸10min。PCR扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳，显示两个PCR体系分别扩增得到一条1000左右条带，和一条1100左右条带，大小与预期结果一致。切胶回收同源重组的方法克隆至pET21a(+)，构建氧化酶pET21a(+)
‑
84，氧化酶的氧化还原酶pET21a(+)
‑
85，转化大肠杆菌DH5α感受态，氨苄青霉素抗性LB培养基培养，挑克隆菌落PCR验证，阳性克隆测序结果显示扩增产物为序列表中SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的核苷酸序列。将pET21a(+)
‑
84，pET21a(+)
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85，重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，氨苄青霉素抗性LB本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种氧化酶，其为具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：1)序列表SEQ ID No.1中的所示氨基酸序列；2)将序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有氧化酶功能的蛋白质。2.一种氧化酶基因，其核苷酸如序列表SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求1所述的氧化酶，其特征在于，所述的氨基酸序列由371个氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志培，刘双江，李德峰，苗莉莉，吴梦茹，刘缨，侯婷婷，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：