用于ATP再生的无细胞组合物及其用途制造技术

一种使用电化学电池(特别是膜生物反应器)向电子传输链提供电子的方法，该电子传输链能够产生质子梯度以从ADP再生ATP。这种电子传输链可以是合成膜的一部分，或者包含在合成膜内，或者可以通过适当地破坏活细胞来制备。电化学电池提供的电子通过合适的电子载体传递至电子传输系统，所述电子载体是例如NADH2、FMNH2、FADH2、还原性泛醌、硫醇或其他电子载体或与实现ATP再生的电子传输链组分相容的生物还原性等价物。还原性等价物。还原性等价物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于ATP再生的无细胞组合物及其用途
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2019年2月12日提交的美国临时专利申请序列号62/804,448的优先权，其公开通过引用全文纳入本文。


[0002]本专利技术一般涉及用于再生三磷酸腺苷(ATP)的无细胞系统，三磷酸腺苷(ATP)广泛用于各种生物介导反应，如肽和蛋白质的合成。

技术介绍

[0003]无细胞合成现在被认为是一种通过生物过程生产有价值的商业化合物的有效方法，无需进行经典发酵；还描述了各种再生ATP的方法，以允许无细胞系统执行需要ATP的操作，如肽合成中的氨基酸偶联。(“合成生物学的原核生物无细胞系统开发”；Abel C.Chiao,Richard M.Murray,Zachary Z.Sim,doi:http://dx.doi.org/10.1101/048710)。
[0004]在无细胞系统中构建所需代谢途径后，主要的实践问题是提供驱动所需代谢途径所需的化学势能。这种化学势能通常以常见的天然三磷酸腺苷(ATP)形式提供。为无细胞系统提供ATP源是一个可观的实践问题，其严重限制了无细胞系统的应用。
[0005]最简单的是，ATP可作为纯化的化合物以化学计量量直接提供给无细胞系统。这即使在实验室规模也是极其昂贵的，在商业规模上经济不可行。
[0006]向无细胞系统提供ATP可通过包括附加代谢途径以及无细胞系统所需的代谢途径来实现。这些附加途径使用较便宜的试剂(如葡萄糖、丙酮酸、琥珀酸、谷氨酸或其他化合物，以化学计量量添加到整个无细胞系统中)在无细胞系统内从ADP再生ATP。这些试剂起到“牺牲底物”的作用，并通过添加到最初存在于无细胞系统中的途径的附加途径发挥作用。但这些附加途径通常不是直接提供无细胞系统所需产物的无细胞系统的途径的一部分。因此，这些附加途径给整个无细胞系统带来了额外的复杂性，随之而来的是低效率和费用。
[0007]因此，需要改进用于体外ATP再生的无细胞系统和方法。

技术实现思路

[0008]在一个方面，本文提供了一种用于再生三磷酸腺苷(ATP)的无细胞组合物，包括：用于向电子受体传递电子的还原的化学物质，其中所述还原的化学物质由电化学装置电化学产生；包含电子受体和ETC复合物IV的电子传输链(ETC)，其中电子受体选自ETC复合物I、ETC复合物II、ETC复合物III、泛醌和细胞色素c，其中所述ETC能够在脂质双层上产生质子梯度；ATP合酶，能够利用跨脂质双层的质子梯度从二磷酸腺苷(ADP)产生ATP；和脂质体，由脂质双层包封以在脂质体内保留质子，其中ETC和ATP合酶与脂质双层联合。
[0009]另一方面涉及一种用于再生三磷酸腺苷(ATP)的装置，包括：包含在阳极室中的阳极和包含在阴极室中的阴极；阳极室中与阳极接触的去离子水；分离阳极室和阴极室的质子透性膜；阴极室中与阴极连续接触的液相，所述液相包括能够经历循环还原和氧化的电子转移介体(ETM)，其中，一旦在阴极处还原，ETM被还原成可将电子转移到电子传输链(ETC)的电子受体的还原化学物质；其中所述电子受体选自ETC复合物I、ETC复合物II、ETC复合物III、泛醌和细胞色素c；其中ETC包含电子受体和ETC复合物IV；合成线粒体，其包括包封的脂质双层、ETC和ATP合酶；其中所述ETC能够在脂质双层上产生质子梯度；其中所述ATP合酶能够利用跨脂质双层的质子梯度从二磷酸腺苷(ADP)产生ATP；其中所述包封的脂质双层能够在其中保留质子；工艺流，包含能够使用产生的ATP生产所需产品的底物；和在阳极和阴极之间提供电压的外部电源。
[0010]在一些实施方式中，还原化学物质可包括NADH2、NADPH2、FMNH2、FADH2和/或泛醇中的一种或多种。在某些实施方式中，还原化学物种为NADH2、NADPH2和/或FMNH2中的一种或多种，且电子受体为ETC复合物I。在某些实施例中，还原化学物质为FADH2，电子受体为ETC复合物II。在某些实施方式中，还原化学物质为泛醇，电子受体为ETC复合物III。
[0011]在某些实施方式中，ETC已重建到脂质体中，以至少部分嵌入脂质双层中，且电子受体可接触到存在于脂质体外部的还原化学物质。在某些实施方式中，ATP合酶已重建到脂质体中以至少部分嵌入脂质双层中，其中ATP合酶可接触存在于脂质体外部的ADP。在一些实施方式中，将ETC和ATP合酶重建为与脂质双层相联合，优选至少部分嵌入其中。
[0012]在某些实施方式中，脂质双层对质子不可透过。在某些实施方案中，脂质体是人工制备的。在某些实施方式中，重组产生ETC和/或ATP合酶。
[0013]在一些实施方式中，装置可包括位于阴极和工艺流之间的膜，其中所述膜支持合成的线粒体并允许液相和工艺流之间的界面接触，同时防止液相和工艺流的实质性混合，并防止工艺流实质性接触阴极。在一些实施方式中，膜配置成与合成线粒体部分联合。在一些实施方式中，膜配置成使得合成线粒体部分或完全嵌入膜内。
[0014]本文还提供了使用本文公开的组合物和装置在体外再生ATP的方法。附图简要说明
[0015]图1说明了通过NADH2的电化学再生向ETC提供电子与从其他化合物和代谢途径提供还原等价物相比的相对简单性。
[0016]图2以示意图的形式说明了生物膜或制备的脂质体膜所包含的电子传输链(ETC)和ATP合酶的组分。
[0017]图3以示意图形式说明了NAD电化学还原为NADH2，并将NADH2提供给合成线粒体，该线粒体利用NADH2通过ETC和ATP合酶将ADP转化为ATP。
[0018]图4以示意图形式说明了NAD电化学还原为NADH2以及NADH2提供给包含在膜基质中的合成线粒体。
具体实施方式
[0019]在一些实施方式中，本专利技术利用电化学装置通过电解水将NAD还原为NADH2(例如，PCT出版物编号WO2017160793A1、WO2016137976A1、W02016070168A1和WO2014039767A1中公开的电化学生物反应器模块(EBM)，均通过引用并入本文)。NADH2随后被合成的线粒体消耗并返回NAD，从中电化学再生NADH2，并且NADH2的异常形式恢复成NAD，以便随后还原。以这种方式，不需要化学计量量的牺牲底物来提供NADH2，或提供通常用于生物系统的还原等价物。定义
[0020]除非另有说明，本文所用的所有科技术语具有本专利技术所属领域普通技术人员通常所理解的含义。
[0021]本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个)该冠词语法上的宾语。术语“一种”或“一个”当与“包含”在本文中联用时，可表示“一个”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。
[0022]如本文所用，“约”和“近似”通常表示在考虑测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差度。示例性误差度在给定数值范围的20％以内，通常在10％以内，更通常本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于再生三磷酸腺苷(ATP)的无细胞组合物，包括：用于向电子受体传递电子的还原化学物质，其中所述还原化学物质由电化学装置电化学生成；包含电子受体和ETC复合物IV的电子传输链(ETC)，其中电子受体选自ETC复合物I、ETC复合物II、ETC复合物III、泛醌和细胞色素c，其中所述ETC能够产生跨脂质双层的质子梯度；ATP合酶，能够利用跨脂质双层的质子梯度从二磷酸腺苷(ADP)产生ATP；和脂质体，由脂质双层包封以在脂质体内保留质子，其中ETC和ATP合酶与脂质双层联合。2.根据权利要求1所述的无细胞组合物，其中所述还原化学物质为NADH2、NADPH2、FMNH2、FADH2和/或泛醇中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的无细胞组合物，其中所述还原化学物质为NADH2、NADPH2和/或FMNH2中的一种或多种，其中电子受体是ETC复合物I。4.根据权利要求1所述的无细胞组合物，其中该还原化学物质是FADH2，且其中该电子受体是ETC复合物II。5.根据权利要求1所述的无细胞组合物，其中该还原化学物质是泛醇，其中该电子受体是ETC复合物III。6.根据权利要求1所述的无细胞组合物，其中ETC已重建到脂质体中，以至少部分嵌入脂质双层中，且电子受体可接触到脂质体外部存在的还原化学物质。7.根据权利要求1所述的无细胞组合物，其中ATP合酶已重建到脂质体中以至少部分嵌入脂质双层中，其中ATP合酶可接触到存在于脂质体外部的ADP。8.根据权利要求1所述的无细胞组合物，其中该脂质双层对质子不可透过。9.根据权利要求1所述的无细胞组合物，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：W，
申请(专利权)人：百奥堪引赛股份有限公司，
类型：发明
国别省市：