胺脱氢酶突变体及其在制备(S)-5-甲基-2-吡咯烷酮中的应用制造技术

本发明专利技术涉及胺脱氢酶突变体及其在制备(S)

【技术实现步骤摘要】
胺脱氢酶突变体及其在制备(S)
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甲基
‑2‑
吡咯烷酮中的应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种催化性能明显提高的胺脱氢酶突变体、其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该胺脱氢酶突变体或重组表达转化体催化潜手性羰基化合物，制备光学纯的氨基酸，特别是催化乙酰丙酸不对称还原以制备光学纯的内酰胺(S)
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甲基
‑2‑
吡咯烷酮的应用。

技术介绍

[0002]内酰胺是有机化学中的关键化合物，因为它们存在于许多生物活性产品中，也可作为包括合成聚合物在内的更复杂结构的有价值的中间体。除了构成目前的抗生素中最重要的一类β
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内酰胺(2
‑
氮杂环丁酮)之外，γ
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内酰胺(2
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吡咯烷酮)和δ
‑
内酰胺(2
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哌啶酮)的合成也在这几年也广受关注。其次内酰胺是自然界中广泛存在的天然产物片段，研究发现内酰胺多存在于陆上及海洋生物中(细菌、真菌、蓝藻、海绵)。经报道，天然源内酰胺类衍生物具有十分显著且广泛的生物活性，如杀虫、除草、抗病毒、抗肿瘤、抗炎等活性。因此，寻找一种产率高、立体选择性高的内酰胺合成途径将有很大的经济价值。
[0003]5‑
甲基
‑2‑
吡咯烷酮是一种重要的化学品和医药、农药等合成的中间体，可由生物质可再生资源衍生物乙酰丙酸及其酯通过催化加氢还原胺化制得。通常的合成方法是以氢气为氢源、以氨气或者有机胺为氮源，在金属催化剂作用下催化乙酰丙酸(酯)制得。
[0004]如Shilling等以氢气为氢源，以氨气为氮源，以硅藻土负载的镍作为催化剂，200℃下还原胺化乙酰丙酸合成5
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甲基
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吡咯烷酮，收率为87％(Shilling,WilburL.Pyrrolidinones:US3,235,562[P].1966.2.15.)。
[0005]2017年，王等人以甲酸铵为氢源和氮源，N,N
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二甲基甲酰胺为溶剂，探讨了甲酸铵直接还原胺化乙酰丙酸制备5
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甲基
‑2‑
吡咯烷酮的反应途径及机理，并且优化了反应条件，但是其立体选择性中等(生物质化学工程,2017,51(02):19
‑
25.)。
[0006]中国专利技术专利申请公开号CN1764376A公开了一种利用任选地有载体的金属催化剂，通过乙酰丙酸与硝基化合物的还原胺化，生产5
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甲基
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N
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芳基
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吡咯烷酮、5
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甲基
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N
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环烷基
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吡咯烷酮、和5
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甲基
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N
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烷基
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吡咯烷酮的方法，也需要氢气为还原剂，产物立体选择性差，甚至低于10％。
[0007]中国专利技术专利申请公开号CN110615754A公开了一种5
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甲基
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吡咯烷酮的制备方法，以生物质衍生物乙酰丙酸为起始原料，以甲酸铵为氢源和氮源，以负载型双金属催化剂为加氢催化剂，在水中采用“一锅法”合成5
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甲基
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吡咯烷酮，所述的负载型双金属催化剂的负载金属为两种贵金属组成的双金属、一种贵金属与一种非贵金属A或非贵金属B组成的双金属、或一种非贵金属A与一种非贵金属B组成的双金属。本专利技术方法乙酰丙酸转化率可达到100％，5
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甲基
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吡咯烷酮的收率可达94％以上。
[0008]2018年，Angela等人主要介绍了一种γ
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和δ
‑
内酰胺的生物合成路线，通过转氨酶的催化作用还原胺化酮酯类底物(异丙胺IPA作为胺供体),再通过中间产物分子内的自身
环化，生成内酰胺。对所测试的所有底物进行制备实验，产物的转化率在66％
‑
89％，ee值大于91％。该文章描述了一种简单明了的一锅两步法，可将不同的γ
‑
和δ
‑
酮酸酯转化为相应的旋光内酰胺。该策略基于选择性的生物转氨反应，该反应允许形成氨基酯中间体在自身的水性介质中进行自发的分子内环化反应，而无需添加外部试剂，但是第一步还原胺化需要加入胺供体，因此整个反应有副产物生成并且产率较低(Advanced Synthesis&Catalysis,2018,360(4):686
‑
695)。
[0009]综上所述，合成获得5
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甲基
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吡咯烷酮的方法已经报道了很多，可以通过化学或生物催化方法获得，但是化学方法存在很多缺点，例如：非对映选择性差，反应环境不温和，副产物较多。转氨酶催化还原胺化酮酯类底物，需要提供胺供体，并且酶活较低。

技术实现思路

[0010]针对现有技术胺脱氢酶的不足，本专利技术提供胺脱氢酶突变体及其在制备(S)
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甲基
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吡咯烷酮中的应用。
[0011]具体而言，本专利技术针对现有技术胺脱氢酶的不足，通过蛋白质工程和定向进化的手段对其进行改造，进一步提高该突变体对乙酰丙酸的活性，提供了催化性能明显提高的胺脱氢酶突变体、其编码基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该胺脱氢酶突变体或重组表达转化体催化潜手性羰基化合物，制备光学纯的氨基酸，特别是催化乙酰丙酸不对称还原以制备光学纯的内酰胺(S)
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甲基
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吡咯烷酮的应用。
[0012]基于本专利技术的技术方案，可以充分实现胺脱氢酶突变体的商业价值，并降低酶催化剂的应用成本，有效简化合成内酰胺化合物的合成工艺。
[0013]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0014]本专利技术的技术方案之一，获得催化性能明显改善的胺脱氢酶突变体。
[0015]本专利技术中，以来自Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus的胺脱氢酶TtherAmDH
WT
作为母本，采用易错PCR、定点饱和突变、迭代组合等突变策略对其进行定向进化，结合酶标仪高通量初筛和紫外分光光度计复筛，鉴别催化性能改善的胺脱氢酶。
[0016]本专利技术胺脱氢酶突变体(以下简称TtherAmDH突变体)，其是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第11位亮氨酸、第24位苯丙氨酸、第41位精氨酸、第82位缬氨酸、第102位苏氨酸、第198位甘氨酸、第226位脯氨酸、第268位谷氨酰胺或第298位谷氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胺脱氢酶突变体，其特征在于，其是将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第11位亮氨酸、第24位苯丙氨酸、第41位精氨酸、第82位缬氨酸、第102位苏氨酸、第198位甘氨酸、第226位脯氨酸、第268位谷氨酰胺或第298位谷氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，且所述衍生蛋白质具有高于SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的催化性能。2.根据权利要求1所述胺脱氢酶突变体，其特征在于，所述胺脱氢酶突变体的氨基酸序列选自如下中的一种：(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第298位谷氨酸替换为甘氨酸；(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第298位谷氨酸替换为甘氨酸，第82位缬氨酸替换为苏氨酸；(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第298位谷氨酸替换为甘氨酸，第82位缬氨酸替换为苏氨酸，第24位苯丙氨酸替换为甘氨酸；(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第298位谷氨酸替换为甘氨酸，第82位缬氨酸替换为苏氨酸，第24位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第198位甘氨酸替换为丝氨酸；(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第298位谷氨酸替换为甘氨酸，第82位缬氨酸替换为苏氨酸，第24位苯丙氨酸替换为甘氨酸，第198位甘氨酸替换为丝氨酸，第226位脯氨酸替换为丝氨酸；(6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第298位谷氨酸替换为甘氨酸，第82位缬氨酸替换为苏氨酸，第24位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第198位甘氨酸替换为丝氨酸，第226位脯氨酸替换为丝氨酸，第102位苏氨酸替换为半胱氨酸；(7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第298位谷氨酸替换为甘氨酸，第82位缬氨酸替换为苏氨酸，第24位苯丙氨酸替换为甘氨酸，第198位甘氨酸替换为丝氨酸，第226位脯氨酸替换为丝氨酸，第11位亮氨酸替换为丙氨酸；(8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第298位谷氨酸替换为甘氨酸，第82位缬氨酸替换为苏氨酸，第24位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第198位甘氨酸替换为丝氨酸，第226位脯氨酸替换为丝氨酸，第102位苏氨酸替换为半胱氨酸，第11位亮氨酸替换为丙氨酸；(9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第298位谷氨酸替换为甘氨酸，第82位缬氨酸替换为苏氨酸，第24位苯丙氨酸替换为丝氨酸，第198位甘氨酸替换为丝氨酸，第226位脯氨酸替换为丝氨酸，第102位苏氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：白云鹏，钱源益，张晓彦，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：