一种提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法技术

本申请公开了生物医药技术领域中的一种提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法，添加甘油、葡萄糖、山梨醇、果糖、黄原胶、甘露醇、聚乙二醇或乙二胺四乙酸酶中的一种或几种，添加NADH或NADPH中的一种或几种，可显著提高其储存稳定性和后续酶转化反应的催化效率。通过添加终浓度为1～80％酶稳定剂可将

【技术实现步骤摘要】
一种提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法。

技术介绍

[0002]生物催化反应条件温和、专一性好、副反应少且在催化过程中避免了重金属残留、环境污染等问题，因此生物催化被广泛地用于药物合成。
[0003]细胞色素P450单加氧酶作为生物催化剂的一种，是自然界中最具催化多样性的酶之一，主要参与生物体外源物质代谢与天然产物生物合成，能以结构多样的有机化合物作为底物催化多种类型的化学反应。
[0004]尽管细胞色素P450单加氧酶具有众所周知的优势，但其在工业应用成功的例子仍然有限。这是由于生物催化目前发现的大多数酶是蛋白质，有着许多固有的缺点，如储存稳定性差、需要有效的辅酶再生、易受温度、pH影响等。目前对其储存稳定性的研究，发现绝大多数细胞色素P450单加氧酶储存不到一周就检测不到底物被消耗，说明仅不到一周，绝大多数细胞色素P450单加氧酶已经大部分失活，这也大大限制了其工业应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对现有技术的不足，设计一种操作简便、成本低的提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法。
[0006]一种提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法，将细胞色素P450单加氧酶加入到基础溶液中，再添加酶稳定剂或辅酶添加剂，其中，所述基础溶液为PB、PBS、KPB、Tri
‑
HCl、Tri
‑
H2SO4或者Glycine
‑
NaOH中的一种；所述酶稳定剂为甘油、葡萄糖、山梨醇、果糖、黄原胶、甘露醇、聚乙二醇或乙二胺四乙酸中的一种或几种，所述辅酶添加剂为NADH或NADPH中的一种或几种。
[0007]进一步的，所述细胞色素P450单加氧酶以全细胞、粗酶液、粗酶粉或者纯酶的形式存储。
[0008]进一步的，酶稳定剂加入的终浓度为1％～80％。
[0009]进一步的，辅酶添加剂加入的终浓度为1～30mM。
[0010]进一步的，储存温度为
‑
100℃～0℃之间。
[0011]进一步的，所述甘油的浓度为10％，乙二胺四乙酸的浓度为1％，其余酶稳定剂的浓度均为2％。
[0012]进一步的，所述储存温度为
‑
80℃。
[0013]进一步的，所述辅酶添加剂为NADH，针对于粗酶液添加NADH的浓度为3mM，针对于粗酶粉添加NADH的浓度为10mM。
[0014]进一步的，所述储存温度为
‑
20℃。
[0015]与现有技术相比，本专利技术通过添加终浓度为1％～80％酶稳定剂可将
‑
100℃～0℃
下储存的全细胞、粗酶液、纯酶储存时间延长至180d，且催化性能保持在50％～90％；通过向粗酶粉中添加终浓度为1～30mM的辅酶添加剂，可将后续酶转化反应的催化性能由0％～40％提升至50％～90％，并可以保持其较优催化性能高达180d。这一专利技术有效地解决了细胞色素P450酶在生产过程中存储稳定性差的关键科学问题，为细胞色素P450酶的工业化应用提供了重要的技术支撑。
[0016]本专利技术的方法操作简便、成本低，便于推广利用。
附图说明
[0017]图1是无酶稳定剂在不同储存温度下对P450酶ee值和产率的影响示意图；
[0018]图2是15％甘油作为酶稳定剂在不同储存温度下对P450酶ee值和产率的保护作用示意图；
[0019]图3是不同浓度的甘油作为酶稳定剂在
‑
80℃下对P450酶ee值和产率的保护作用示意图；
[0020]图4是甘油、山梨醇、甘露醇、乙二胺四乙酸及甘油与山梨醇、甘油与甘露醇、甘油与乙二胺四乙酸作为酶稳定剂对P450酶ee值和产率的促进作用示意图；
[0021]图5是甘油、乙二胺四乙酸及甘油与甘露醇作为酶稳定剂对P450酶ee值和产率的保护作用示意图；
[0022]图6是15％甘油作为酶稳定剂对P450酶以全细胞及粗酶粉的形式ee值和产率的保护作用示意图；
[0023]图7是不同浓度的辅酶添加剂NADH对粗酶液催化性能的提升示意图；
[0024]图8是不同浓度的辅酶添加剂NADH对粗酶粉催化性能的提升示意图；
[0025]图9是10mM辅酶添加剂NADH对储存于
‑
20℃的粗酶粉对P450酶ee值和产率的保护作用示意图；
[0026]图10是无辅酶添加剂与10mM辅酶添加剂NADH对储存于
‑
20℃的粗酶粉对P450酶ee值和产率的对照示意图；
[0027]图11是反应产率曲线图及P450酶CO差光谱扫描结果图，其中(b)储存0d；(c)储存5d；(d)储存30d。
具体实施方式
[0028]下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0029]实施例中涉及的P450酶来源于Deinococcus apachensis。
[0030]菌株培养：从TB固体培养基平板上挑取活化后的单菌落接种到50mL TB液体培养基中，加入Kan抗生素，37℃，250rpm下培养8h。按2％体积比将菌液转入100mL TB培养基中，37℃，250rpm下培养3h后加入IPTG诱导蛋白表达，诱导剂终浓度为0.2mM，于25℃，250rpm下诱导10～12h。
[0031]全细胞催化反应：取少量诱导后的菌液稀释10倍用于检测OD
600
值，然后用高速冷冻离心机回收菌体，4℃下9000rpm离心3min，弃上清保留菌体，根据所测量OD
600
值与细胞浓度关系加入相应体积的PB(50mM，pH 8.0,15％v/v Glycerol)作为缓冲溶液，旋涡震荡重新悬浮混匀菌体。细胞浓度为20g cdw/L，2mM 1
‑
氯
‑4‑
苯基
‑3‑
丁烯作为底物，反应条件为10
℃，250rpm，24h。
[0032]粗酶液、纯酶反应体系：5mL PB(50mM，pH 8.0，15％v/v Glycerol)作为缓冲溶液，P450酶量为20g cdw/L，2mM 1
‑
氯
‑4‑
苯基
‑3‑
丁烯作为底物，反应条件为10℃，250rpm，24h。
[0033]粗酶粉反应体系：5mL PB(50mM,pH 8.0,15％v/v Glycerol)作为缓冲溶液，100mg粗酶粉溶于5mL缓冲液中，2mM 1
‑
氯
‑4‑
苯基
‑3‑
丁烯作为底物，反应条件为10℃，250rpm,10h。
[0034]样品制备：待生物催化反应达到反应时间时，加入与反应液等体积含有20mM苯丙醇内标物的乙酸乙酯充分萃取，12000rpm下高速离心混合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法，其特征在于，将细胞色素P450单加氧酶加入到基础溶液中，再添加酶稳定剂或辅酶添加剂，其中，所述基础溶液为PB、PBS、KPB、Tri
‑
HCl、Tri
‑
H2SO4或者Glycine
‑
NaOH中的一种；所述酶稳定剂为甘油、葡萄糖、山梨醇、果糖、黄原胶、甘露醇、聚乙二醇或乙二胺四乙酸中的一种或几种，所述辅酶添加剂为NADH或NADPH中的一种或几种。2.根据权利要求1所述的一种提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法，其特征在于：所述细胞色素P450单加氧酶以全细胞、粗酶液、粗酶粉或者纯酶的形式存储。3.根据权利要求2所述的一种提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法，其特征在于：酶稳定剂加入的终浓度为1％～80％。4.根据权利要求2所述的一种提高细胞色素P450单加氧酶储存稳定性的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张世明，赵茜帆，陈永正，
申请(专利权)人：遵义医科大学，
类型：发明
国别省市：