以高碳效率生产1‑丁醇的电化学生物反应器模块和工程代谢路径制造技术

本文公开了一种用于传递还原当量至细胞的电化学装置和位于所述细胞内的工程改造的代谢路径的组合，所述细胞内的工程改造的代谢路径能够利用所述电化学方式提供的还原当量。这样的组合使化学品的发酵生产具有更高的碳效率。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】以高碳效率生产1-丁醇的电化学生物反应器模块和工程代谢路径相关申请的交叉援引本申请要求2015年2月23日提交的美国临时申请号62/119,265的优先权和权益，其全部内容通过引用纳入本文。
本文公开的内容主要涉及例如电化学生物反应器(EBM)的装置与任选表达于合适宿主细胞内的一个或多个工程改造的代谢路径组合用于以超过现有1-丁醇的发酵生产过程的碳效率将葡萄糖或其它可发酵的碳源转化成1-丁醇。
技术介绍
四碳化合物1-丁醇，作为液体燃料和化学品都具有重要的价值和实用性。特别是，目前对于使用生物丁醇作为运输燃料的兴趣与日俱增。已有多种方法用于生产1-丁醇，包括石化原料丙烯催化反应、乙醇催化二聚反应和ABE发酵，这些方法都有明显的缺陷。对于生产丁醇，特别是生产生物丁醇的新方法的需求十分迫切。1-丁醇通常由石油化工原料丙烯来生产。在氢和一氧化碳存在的情况下，用钴或铑催化剂进行丙烯氢甲酰化反应。这一过程要求100℃至200℃的温度和高达300atm的压力，并且生成大约88％1-丁醇和12％异丁醇的混合物。该反应如下所示。乙醇作为一种二碳醇，可以使用戈尔伯特化学法(Geurbertchemistry)经二聚来生产1-丁醇。这一方法可以使用生物乙醇，从而使得生成的1-丁醇同样是生物源性的。戈尔伯特化学法自19世纪末便被人们所知晓，并且使用此化学法以乙醇生产1-丁醇的专利可追溯到20世纪30年代(美国专利号1992480)。这一过程采用进行一系列反应(氧化、醛醇缩合、脱水和还原)的催化剂，生成较高级醇和一摩尔的水。该反应如下所示。因此，通过催化反应以丙烯或乙醇来生产1-丁醇需要昂贵的催化剂和/或苛刻的反应条件。1-丁醇还可以使用乙酰丁醇梭菌(Clostridiumacetylbutylicum)，通过发酵进行生产。这一发酵过程被称为“丙酮-丁醇-乙醇(ABE)法”，其于20世纪早期由Fernbach和Weizmann申请专利，他们的方法分别在1912和1915年获得专利；Weizmann法(英国专利4845,6，1919年3月)最终主宰了丙酮和丁醇的工业制造。发酵生成丙酮、1-丁醇、乙醇三种溶剂，三种溶剂以大致3:6:1的比例产出。随着分子生物学工具的应用，出现了超高产的布氏梭菌(Clostridiumbeijerincki)菌株，其总溶剂的产率达到了165g/L1-丁醇(N.Qureshi,H.P.Blaschek,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.,2001,27,287-291)。用于ABE发酵的梭状芽胞杆菌(Clostridia)的代谢是复杂的，其间经过产酸阶段，在该阶段中乙酸和丁酸生成并从细胞中分泌，其后进入产溶剂阶段，在该阶段中乙酸和丁酸被细胞摄取并且还原成乙醇，丙酮和丁醇。代谢路径经工程改造后，宿主生物体能够避免这一复杂的反应，并且使用如下一系列的酶由乙酰辅酶A生成1-丁醇：乙酰辅酶-乙酰基转移酶(AtoB)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(Hdb)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(Crt)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter)和醛/醇脱氢酶(AdhE2)(ShotaAtsumi等,MetabolicEngineering10(2008)305–311)。不考虑细胞的代谢或原有路径，按照化学计量平衡的碳效率是三分之二，也就是说，初始葡萄糖(C6H12O6)的6个碳原子中只有4个包含在产出的1-丁醇(C4H10O)中；其余2个碳原子以2分子二氧化碳的形式流失。如以下平衡方程式所示，这是理论上葡萄糖发酵生产1-丁醇的最大碳效率。方程式I：C6H12O6→C4H10O+2CO2+H2O美国总计1300亿加仑/年的汽车燃料市场中生物燃料现在约占10％。通过将1-丁醇生产的理论碳效率从66.6％提高至100％，也就是说，如果初始葡萄糖的全部碳元素都能够包含在产生的1-丁醇中，这将使原材料的产率提高50％。以1-丁醇为例的高级生物燃料持续渗透进入汽车燃料市场，目标是到2020年达到360亿加仑。提高的碳效率能够用现今工艺生产240亿加仑所需的生物质和淀粉生产360亿加仑，从而使得生物燃料更加具有竞争力。因此，迫切地需要提高葡萄糖发酵生产1-丁醇的碳效率。方程式I中另一个问题是CO2的生成，它是没有转换成目标1-丁醇产物而流失的碳。许多年前人们就已经意到生物方法和非生物方法中的CO2流矢并希望能够回收CO2(P.G.Russell等,J.Electrochem.Soc.1977,124(9),1329-1338)。用电化学方法(NeilS.Spinner等,Catal.Sci.Technol.,2012,2,19–28)、光化学方法(MicheleAresta等,BeilsteinJ.Org.Chem.2014,10,2556–2565)和标准化学方法将二氧化碳还原为甲醇可见于出版物(RobynObert等,J.Am.Chem.Soc.1999,121,12192-12193；Song-weiXu等,Ind.Eng.Chem.Res.2006,45,4567-4573；XiaoliWang等,ACSCatal.2014,4,962-972；TorstenRedaetal.,PNAS2008105(31),10654–10658)和专利(美国专利号6440711B1，2002年8月27日)。有人提出了将电化学产生的还原当量用于某种形式的人工光合作用，在该方法中，电化学提供的还原当量取代了那些原本由光合系统I提供的还原当量(“在燃烧后捕获二氧化碳化学研究中的最新进展(InRecentAdvancesinPost-CombustionCO2CaptureChemistry)”；Attalla,M.；美国化学学会讨论会(ACSSymposiumSeries)；美国化学学会(AmericanChemicalSociety):Washington,DC,2012)。然而，这个方案仅仅生成了淀粉，并且还消耗了一些丙酮酸来转化为乙醇和二氧化碳以平衡ATP的需求。人们探索从工业废气捕获CO2来提高碳效率(MicheleAresta,AngelaDibenedetto,AntonellaAngelini,Chem.Rev.,2014,114(3),1709–1742；MicheleAresta,AngelaDibenedetto,DaltonTrans.,2007,2975-2992)，即将CO2还原成甲酸盐，这存在着液体内气体传输的问题，并且要在还原成甲酸之前由CO2形成碳酸和碳酸氢盐。CO2还原成甲酸盐从能量上讲是不利的(ColinFinn,SorchaSchnittger,LesleyJ.Yellowlees,JasonB.Love,Chem.Commun.,2012,48,1392–1399；F.SuhanBaskaya,XueyanZhao,MichaelC.Flickinger,PingWang,ApplBiochemBiotechnol(2010)162:391–398)，并且当可能同时需要为了避免液体内气体传输的问题而先用碳酸酐酶催化CO2转化为碳酸时(PaulK.Addo,Rober本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于生产1‑丁醇的系统，其包括：电化学生物反应器模块，用于提供还原当量；第一工程改造的路径，用于由乙酰辅酶A生成1‑丁醇；和第二工程改造的路径，用于由丙酮酸盐回收甲酸盐形式的碳，并且将所述回收的甲酸盐转化为果糖‑6‑磷酸；其中，所述还原当量被提供给所述第一和/或第二工程改造的路径中的一种或多种氧化还原酶；并且其中所述第一和第二工程改造的路径任选地存在于工程改造的细胞中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.02.23 US 62/119,2651.一种用于生产1-丁醇的系统，其包括：电化学生物反应器模块，用于提供还原当量；第一工程改造的路径，用于由乙酰辅酶A生成1-丁醇；和第二工程改造的路径，用于由丙酮酸盐回收甲酸盐形式的碳，并且将所述回收的甲酸盐转化为果糖-6-磷酸；其中，所述还原当量被提供给所述第一和/或第二工程改造的路径中的一种或多种氧化还原酶；并且其中所述第一和第二工程改造的路径任选地存在于工程改造的细胞中。2.如权利要求1所述系统，其中所述第一工程改造的路径包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶(AtoB,EC2.3.1.9)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(Hbd,EC1.1.1.157)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱水酶(Crt,EC4.2.1.5)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter,EC1.3.1.38)和醛/醇脱氢酶(AdhE2,EC1.2.157/EC1.1.1.1)。3.如权利要求1或2所述系统，其中所述第二工程改造的路径包括丙酮酸:甲酸裂解酶(Pfl,EC2.3.1.54)、甲醛脱氢酶(Fld,EC1.2.1.46)、己酮糖-6-磷酸合酶(HPS,EC4.1.2.43)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(HPI,EC5.3.1.27)。4.如权利要求1或2所述系统，其中在所述工程改造的细胞中，内源性丙酮酸脱氢酶(Pdh,EC1.2.4.1)已被失活、去除或以其它方式使其无功能。5.如权利要求1或2所述系统，其中在所述工程改造的细胞中，内源性富马酸还原酶(FrdBC,EC1.3.1.6)、乳酸脱氢酶(Ldh,EC1.1.1.27)、乙醛脱氢酶(AdhE,EC1.2.1.10)和/或乙酰辅酶A-磷酸乙酰基转移酶(Pta,EC2.3.1.8)已被失活、去除或以其它方式使其无功能。6.如权利要求1或2所述系统，其中所述一种或多种氧化还原酶选自：甲醛脱氢酶(Fld,EC1.2.1.46)、3-羟基丁酰基-辅酶A脱氢酶(Hbd,EC1.1.1.157)、反式-烯酰基-辅酶A还原酶(Ter,EC1.3.1.38)和醛/醇脱氢酶(AdhE2,EC1.2.157/EC1.1.1.1)。7.如权利要求1至6中任一项所述系统，其中所述还原当量通过电子传递介质(ETM)传递。8.如权利要求7所述系统，其中所述ETM选自以下一种或多种：中性红、亚甲基蓝、甲基紫精、...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·R·道茨，W·B·阿米格，M·科法斯，
申请(专利权)人：百奥堪引赛股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US