使用具有辅因子回收的电化学生物反应器模块的改进方法技术

本文提供了使用电化学装置将磷酸化或非磷酸化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化态还原至还原态的组合物和方法，其中电化学还原的不需要的产物作为磷酸化或非磷酸化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化态回收，并返回电化学装置进行还原。

Improvement of electrochemical bioreactor module with cofactor recovery

In this paper, the composition and method of reductive reduction of phosphorylated or non-phosphorylated nicotinamide adenine dinucleotides by electrochemical device are provided. The unnecessary products of electrochemical reduction are recovered as oxidative state of phosphorylated or non-phosphorylated nicotinamide adenine dinucleotides and returned to electrochemical device for reduction.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用具有辅因子回收的电化学生物反应器模块的改进方法相关申请的交叉引用本申请要求2016年3月14日提交的美国临时申请第62/308,175号的优先权权益，通过引用将该申请的公开内容全文纳入本文。
本公开一般涉及改变化合物的氧化态的生物介导反应的用途，特别是涉及改变给定化学化合物中碳原子的氧化态的生物介导反应的用途。更具体地，本公开涉及利用电化学生物反应器模块(EBM)的改进方法，其中在氧化形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子的电化学还原期间产生的不需要形式的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子通过EBM被回收用于再循环。
技术介绍
已经广泛报道了进行还原并且能够将所提供的底物还原成所需还原产物的酶的使用。(Dodds等人,J.Am.Chem.Soc.,(1988)110(2),577-583；Dodds等人,ProceedingsChiralEurope’95.伦敦,(1995),55-62；A.Liese等人,ApplMicrobiolBiotechnol(2007)76:237–248；Liese,A.；第2版.EnzymeCatalysisinOrganicSynthesis(有机合成中的酶催化),(2002),3,1419-1459；Kula,M.R.；Kragl,U.Stereoselect.Biocatal.(2000),839–866；Chartrain,M.；Greasham,R.；Moore,J.；Reider,P.；Robinson,D.；Buckland,B.J.Mol.Catal.B:Enzym.(2001),11,503–512；Patel,R.N.EnzymeMicrob.Technol.(2002),31,804–826；Patel,R.N.Adv.Appl.Microbiol.(2000),47,33–78；Patel,R.N.；Hanson,R.L.；Banerjee,A.；Szarka,J.Am.OilChem.Soc.(1997),74,1345–1360；Hummel,W.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.(1997),58,145–184；Whitesides等人,Appl.Biochem.andBiotech.(1987)14,147-197；Whitesides等人,BiotechnologyandGeneticEngineeringReviews(生物技术与基因工程综述),第6卷.9月，1988)。为了实现所提供的底物的这种还原，必须向反应提供电子。在体内和体外的生物系统中，这些通常称为“还原当量”的电子由通常称为“辅因子”的小分子提供。最常见的辅因子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD。还存在磷酸化形式的辅因子，并且两种形式都向催化需要还原当量的反应的酶提供还原当量。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子以氧化态和还原态存在，并且在公开文献中它们分别缩写为NAD(P)+和NAD(P)H。但是，这里将避免使用这些缩写。最通常地，从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子的还原态接受还原当量的酶被称为“氧化还原酶”，并且被国际生物化学和分子生物学联合命名委员会(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology)分类为EC1.n.n.n。特别感兴趣的是EC1.1.n.n和EC1.2.n.n类中通常称为“脱氢酶”或“酮还原酶”的酶，以及EC1.13.n.n和EC.1.14.n.n类中称为“单加氧酶”的酶。最后一组酶也称为“P450”酶或“CYP”酶。当使用在诸如碳水化合物的碳源上生长的微生物进行由这些酶催化的反应时，通过将一部分碳水化合物氧化成CO2来产生还原当量，即，提供给微生物的一些碳水化合物牺牲性地氧化，以便为微生物提供电子以用于各种代谢过程。虽然所得到的电子对于微生物是理想的和有用的，但是通过氧化为CO2而牺牲的碳原子会损失。还可以提供除碳水化合物之外的碳源，其也被牺牲以产生所需的还原当量。很明显，虽然这种体内过程可以进行氧化还原酶催化的所需反应，但是可能难以从体内系统的环境中回收所需的产物，例如发酵液。因此利用体外系统进行所需反应是有利的。可以分离所需的氧化还原酶并将其用于体外催化反应。通过体外系统可以实现明显改善的化学过程，该系统允许在类似于标准催化化学过程的过程中使用过多的氧化还原酶。这样的系统避免了从发酵液中回收所需反应产物的问题，并且还提供以下优点：允许在非生理条件下使用酶，可以使用多种方法固定或以其他方式容纳酶，并允许其长时间使用。这种固定或其他容纳方法还允许从酶系统中简单有效地回收所需的反应产物。在无细胞系统中使用分离的酶的另一个优点是可以使用多种酶，从而允许进行一系列反应。含有有用的氧化还原酶的微生物在自然界中是众所周知的，并且可以通过简单的筛选快速发现(A.Zaks等人，Tetrahedron(2004)60,789-797)。如果需要特定的氧化还原酶，可以在标准的工业上有用的宿主如酿酒酵母(S.cerevisiae)或大肠杆菌(E.coli)中容易地克隆和过表达酶，通过标准方法分离，并用于体外系统。然而，仍然必须向这种体外系统提供还原当量。类似于体内系统，可以提供被氧化的牺牲性底物。这产生所需的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子的还原态，以为所需反应提供还原当量。显然，对牺牲性底物的需要除去了体内系统的至少一些优点，因为现在必须将次要产物(牺牲性底物的氧化产物)与所需产物分离。虽然甲酸盐可以用作牺牲性底物，因此产生CO2，但是这需要使用另外的酶，即甲酸脱氢酶，这可能不方便。因此，最理想的是以不需要牺牲性底物或其他酶的方式提供反应所需的电子，即氧化还原酶所需的还原当量。如果可以从外部源提供电子，即电流，那么将消除提供牺牲性底物以提供电子的需要，并且氧化还原酶可以用作常规催化剂，从而在不需要活细胞或相关的酶系统或过程的情况下进行反应。其他人已经认识到这种情况，并且已经发表了许多通过电化学方法将电子传递给生物系统的尝试。Park和Zeikus在J.Bacteriol.181:2403-2410,1999中报道了称为中性红(NeutralRed)的化合物将与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子进行可逆的化学氧化还原，即还原形式的中性红(NR还原)具有足够低的氧化还原值，它会将电子转移给烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子并因此将其从氧化态还原为还原态。在这个过程中，中性红被氧化成NR氧化物质，该NR氧化物质随后可以从阴极接受电子，从而回到还原形式NR还原，进而可以再次还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子的氧化态。Zeikus等人的美国专利第7,250,288B2号讨论了改善电化学生物反应器系统中电极效率的需要，并提出了改进方法，例如将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子、中性红和富马酸还原酶与电极连接以改善电子转移特性。虽然上述方法可以改善电子转移特性，但是改进电化学生物反应器系统设计及其以其他方式(例如下面描述的那些方式)的使用也可能是有利的。在PCT公开号WO2014039767A1，“电化学生物反应器模块及其使用方法(ElectrochemicalBioreactorModulea本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种电化学产生NAD(P)H2还原当量的系统，该系统包括：a.电化学电池，其包括容纳在阳极室中的阳极和容纳在阴极室中的阴极；b.含有NAD(P)的第一工艺流，其通过阴极室并与阴极持续接触，电子从阴极转移到NAD(P)，以产生含有还原物质1,4‑NAD(P)H2、1,2‑NAD(P)H2、1,6‑NAD(P)H2和[NAD(P)]2的第二工艺流，同时任选地产生氢；c.氧化还原酶或P450酶的底物，当该底物在氧化还原酶或P450酶存在下与第二工艺流接触时，其转化为产物，同时消耗第二工艺流中的1,4‑NAD(P)H2，并产生第一回收NAD(P)和第三工艺流；和d.肾胺酶、绿豆酚氧化酶和约254nm或超过约320nm的波长下的光照中的至少一种，当这些条件与第三工艺流接触时，将该工艺流中的1,2‑NAD(P)H2、1,6‑NAD(P)H2和[NAD(P)]2中的至少一种转化为第二回收NAD(P)和任选的第三回收NAD(P)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.14 US 62/308,1751.一种电化学产生NAD(P)H2还原当量的系统，该系统包括：a.电化学电池，其包括容纳在阳极室中的阳极和容纳在阴极室中的阴极；b.含有NAD(P)的第一工艺流，其通过阴极室并与阴极持续接触，电子从阴极转移到NAD(P)，以产生含有还原物质1,4-NAD(P)H2、1,2-NAD(P)H2、1,6-NAD(P)H2和[NAD(P)]2的第二工艺流，同时任选地产生氢；c.氧化还原酶或P450酶的底物，当该底物在氧化还原酶或P450酶存在下与第二工艺流接触时，其转化为产物，同时消耗第二工艺流中的1,4-NAD(P)H2，并产生第一回收NAD(P)和第三工艺流；和d.肾胺酶、绿豆酚氧化酶和约254nm或超过约320nm的波长下的光照中的至少一种，当这些条件与第三工艺流接触时，将该工艺流中的1,2-NAD(P)H2、1,6-NAD(P)H2和[NAD(P)]2中的至少一种转化为第二回收NAD(P)和任选的第三回收NAD(P)。2.如权利要求1所述的系统，其包括用于将1,2-NAD(P)H2和1,6-NAD(P)H2转化为第二回收NAD(P)的肾胺酶。3.如权利要求1所述的系统，其包括用于将1,2-NAD(P)H2、1,6-NAD(P)H2和/或[NAD(P)]2转化为第二回收NAD(P)和/或第三回收NAD(P)的绿豆酚氧化酶。4.如权利要求1所述的系统，其包括用于将[NAD(P)]2转化为NAD(P)的光照。5.如权利要求1所述的系统，其包括肾胺酶和绿豆酚氧化酶。6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，第三工艺流与肾胺酶接触，使得1,2-NAD(P)H2和1,6-NAD(P)H2转化为第二回收NAD(P)以及得到第四工艺流，其中第四工艺流与绿豆酚氧化酶接触以将其中的[NAD(P)]2转化为第三回收NAD(P)。7.如权利要求1所述的系统，其包括肾胺酶和光照。8.如权利要求7所述的系统，其特征在于，第三工艺流与肾胺酶接触，使得1,2-NAD(P)H2和1,6-NAD(P)H2转化为第二回收NAD(P)以及得到第四工艺流，其中第四工艺流与光照接触以将其中的[NAD(P)]2转化为第三回收NAD(P)。9.如权利要求1所述的系统，其包括绿豆酚氧化酶和光照。10.如权利要求8所述的系统，其特征在于，第三工艺流与绿豆酚氧化酶接触，使得1,2-NAD(P)H2和1,6-NAD(P)H2转化为第二回收NAD(P)以及得到第四工艺流，其中第四工艺流与光照接触以将其中的[NAD(P)]2转化为第三回收NAD(P)。11.如权利要求1-10中任一项所述的系统，所述系统在一个或多个工艺流中还包括能够将电子转移至NAD(P)的电子转移介体(ETM)。12.如权利要求1-10中任一项所述的系统，所述系统还包括过氧化氢酶，用于分解由肾胺酶、绿豆酚氧化酶和/或光照产生的过氧化氢。13.如权利要求1-10中任一项所述的系统，其特征在于，所述肾胺酶是突变形式，其对1,4-NAD(P)H2的氧化活性比野生型肾胺酶低，并且/或者对1,2-NAD(P)H2和1,6-NAD(P)H2的氧化活性比野生型肾胺酶高，其中优选突变形式是由诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和巨大芽孢杆菌的微生物重组表达的。14.如权利要求1-10中任一项所述的系统，其特征在于，所述肾胺酶和/或绿豆酚氧化酶是由诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和巨大芽孢杆菌的微生物重组表达的。15.如权利要求1-10中任一项所述的系统，其特征在于，所述绿豆酚氧化酶是突变形式，其对1,4-NAD(P)H2的氧化活性比野生型绿豆酚氧化酶低，并且/或者对1,2-NAD(P)H2、1,6-NAD(P)H2和/或[NAD(P)]2的氧化活性比野生型绿豆酚氧化酶高，其中优选突变形式是由诸如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和巨大芽孢杆菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·S·莫里森，W·B·阿米格，D·R·道茨，M·科法斯，
申请(专利权)人：百奥堪引赛股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US