使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，包括使用目的基因和质粒构建重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，验证并选择转化成功的重组大肠杆菌加以诱导和培养，使其产生目标环二核苷酸，并从培养物分离纯化所述环二核苷酸。本发明专利技术方法的步骤较少，所需原材料和设备较少，从而显著降低生产成本，且产率较高。

【技术实现步骤摘要】
使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法
本专利技术涉及使用重组微生物发酵制备环二核苷酸的领域，具体而言涉及使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法。
技术介绍
环二核苷酸（CDNs）是细菌和哺乳动物细胞中广泛存在的第二信使分子，包括c-di-GMP、c-di-AMP、3’3’-cGAMP和2’3’-cGAMP等，在调节病原微生物的致病性、形态方面，以及哺乳动物先天免疫应答中具有重要的作用。环二核苷酸可被人体的免疫系统识别以抵抗病原微生物的进攻，同时可通过刺激肿瘤患者的免疫系统而杀伤肿瘤细胞，具有良好的药物开发前景。天然环二核苷酸的大量制备一直受限于其较高的成本以及相对繁琐的步骤。因此，开发一种可靠、简单、有效的大量制备环二核苷酸（CDNs）的生产方法具有重要意义。目前，环二核苷酸的制备主要通过化学合成和酶合成等方法制备，但化学合成方法需要使用多种保护基团，耗时长，步骤多且不环保，而酶合成方法需要使用成本较高的底物GTP和高效高纯的酶蛋白，因此目前市售CDNs的价格仍然非常昂贵，达4000-6000元/mg。尤其2’3’-cGAMP作为人类先天免疫中的重要信号分子，自发现后就成为热点明星分子，具有很大的潜在使用需求，但目前仅见少量关于其少量合成的文献报道。CN104152472A公开以来自野油菜黄单胞菌的双鸟苷酸环化酶基因构建重组载体，转化至大肠杆菌中，获得重组基因工程菌来生产重组双鸟苷酸环化酶，再用所述酶催化GTP产生c-di-GMP。CN106318997A公开以鼠源cGAMP合成酶cGAS基因构建重组载体，转化至大肠杆菌中，发酵生产cGAS酶。合成腺苷（鸟苷）5’-α硫代（硒代）磷酸三磷酸作为底物，用所述cGAS酶催化生产硫（硒）代磷酸环二核苷酸cGAMP。该等现有技术的缺点在于，使用重组微生物制备环化酶，仍需购买或合成大量底物，而且需要先将所产生的酶从培养物中提取出来，并且需要反应设备使酶催化底物反应，才能获得最终产物环二核苷酸。步骤仍较繁琐，且成本较高。CN106086040A公开以海洋细菌基因Lfliz构建重组载体，并转化至大肠杆菌中，产生Lfliz蛋白，来获得四种2’,3’-环形核苷单磷酸。但Lfliz蛋白本身并不催化产生环形核苷酸的反应，而是可结合所述四种2’,3’-环形核苷单磷酸，便于将其从细胞中提取出来。故产率较低，每升培养物仅有约2.5mg目标产物。因此，业内需要简单、经济且高效的环二核苷酸制备方法。
技术实现思路
为满足上述需求，本专利技术提供一种使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法。本专利技术的技术方案为，一种使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，包含以下步骤：1）构建重组载体，使用目的基因和质粒构建重组载体；2）转化，将所述重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中；3）阳性克隆验证，验证并选择转化成功的重组大肠杆菌克隆；4）诱导，添加诱导剂，诱导所述转化成功的重组大肠杆菌发酵产生所述环二核苷酸；5）分离纯化，从所述重组大肠杆菌培养物中（菌体或培养基）分离所述环二核苷酸并纯化。所述环二核苷酸分别是2’3’-环鸟苷腺苷单磷酸(2’3’-cGAMP)、环二鸟苷酸(c-di-GMP)和3’3’-环鸟苷腺苷单磷酸(3’3’-cGAMP)，均属于天然存在的环二核苷酸信号分子。所述大肠杆菌感受态细胞为BL21(DE3)或BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株。在一个方面中，所述环二核苷酸为2’3’-cGAMP，所述目的基因为鼠源环GMP-AMP合成酶cGAS酶基因。所述质粒为pet28a质粒，使用限制性酶切位点BamHI和XhoI将所述鼠源cGAS酶基因构建至所述pet28a质粒中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株。对于2’3’-cGAMP，所述诱导是在LB培养基和改良M9极限培养基中进行的。所述改良M9极限培养基是如下制备的：将Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、NH4Cl和去离子水以约34:6:1:2:400（质量比）混合形成5×M9盐溶液。之后将5×M9盐溶液、1mol/LMgSO4、0.1mol/LCaCl2、20%葡萄糖溶液、1mol/LFeSO4和去离子水灭菌后以约200:5:1:40:0.01:760（体积比）混合，制得改良M9极限培养基。对于2’3’-cGAMP，所述分离纯化包括以下步骤：a)取培养上清液，抽滤，酸化，抽滤；b)使用大孔吸附树脂柱对步骤a)所得产物进行层析，获得第一2’3’-cGAMP粗品；c)使用离子交换树脂柱对所述第一2’3’-cGAMP粗品进行层析，获得第二2’3’-cGAMP粗品；d)使用C18柱对所述第二2’3’-cGAMP粗品进行层析，获得第三2’3’-cGAMP粗品；e)使用葡聚糖凝胶色谱柱对所述第三2’3’-cGAMP粗品进行层析，收集主峰，干燥后获得纯2’3’-cGAMP。在另一方面中，所述环二核苷酸为c-di-GMP，所述目的基因为海栖热袍杆菌(Thermotogamaritime)的二鸟苷酸环化酶tDGCR158A基因tDGCm和人源干扰素刺激基因STINGCTD。所述质粒为经改造pet15b和pet30a质粒，所述pet15b的N端的凝血蛋白酶位点被PPase蛋白酶位点取代，使用限制性酶切位点BamHI和XhoI将所述tDGCm基因构建至所述pet15b质粒中，且使用限制性酶切位点NdeI和XhoI将所述STINGCTD基因构建至所述pet30a质粒中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21(DE3)菌株。对于c-di-GMP，所述分离纯化包括以下步骤：a)取培养物，加入双蒸水重悬菌体，加热、混匀并离心；b)取上清液，加入冷乙醇，混匀后静置，离心；c)取上清液，加入NaCl和EDTA，混匀后静置，离心；d)弃去上清液，用双蒸水重悬沉淀，使用氨基丙柱进行层析，获得第一c-di-GMP粗品；e)使用C18柱对所述第一c-di-GMP粗品进行层析，获得第二c-di-GMP粗品；f)使用葡聚糖凝胶色谱柱对所述第二c-di-GMP粗品进行层析，收集主峰，干燥后获得纯c-di-GMP。在另一方面中，所述环二核苷酸为3’3’-cGAMP，所述目的基因为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)鸟苷酸激酶GMK全长基因、大肠杆菌(Escherichiacoli)核苷二磷酸激酶NDK基因和霍乱弧菌(Vibriocholera)的DncV二核苷酸环化酶vc01791-419截短体基因DncVt。所述质粒为paCYCDuet-1和pet22b质粒，使用限制性酶切位点BamHI和HindIII将所述NDK基因构建至所述paCYCDuet-1质粒中，使用限制性酶切位点NdeI和XhoI将所述GMK基因构建至所述paCYCDuet-1质粒中，且使用限制性酶切位点NdeI和XhoI将所述DncVt基因构建至所述pet22b质粒中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21(DE3)菌株。对于3’3’-cGAMP，所述分离纯化包括以下步骤：a)取培养物，加入含有EDTA和NaCl的缓冲液重悬菌体，混匀，加热并离心；b)取上清液，加入乙醇和NaCl，混匀后静置；c)抽滤，用乙醇洗涤沉淀，然后在双蒸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，其特征在于，包含以下步骤：1）构建重组载体，使用目的基因和质粒构建重组载体；2）转化，将所述重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中；3）阳性克隆验证，验证并选择转化成功的重组大肠杆菌克隆；4）诱导，添加诱导剂，诱导所述转化成功的重组大肠杆菌发酵产生所述环二核苷酸；5）分离纯化，从所述重组大肠杆菌培养物中分离所述环二核苷酸并纯化。

【技术特征摘要】
1.一种使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，其特征在于，包含以下步骤：1）构建重组载体，使用目的基因和质粒构建重组载体；2）转化，将所述重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中；3）阳性克隆验证，验证并选择转化成功的重组大肠杆菌克隆；4）诱导，添加诱导剂，诱导所述转化成功的重组大肠杆菌发酵产生所述环二核苷酸；5）分离纯化，从所述重组大肠杆菌培养物中分离所述环二核苷酸并纯化。2.根据权利要求1所述的使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，其特征在于，所述环二核苷酸分别是2’3’-环鸟苷腺苷单磷酸2’3’-cGAMP、环二鸟苷酸c-di-GMP和3’3’-环鸟苷腺苷单磷酸3’3’-cGAMP，均属于天然存在的环二核苷酸信号分子。3.根据权利要求2所述的使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，其特征在于，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21(DE3)或BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株。4.根据权利要求3所述的使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，其特征在于，所述环二核苷酸为2’3’-环鸟苷腺苷单磷酸2’3’-cGAMP，所述目的基因为鼠源环GMP-AMP合成酶cGAS酶基因。5.根据权利要求4所述的使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，其特征在于，所述质粒为pet28a质粒，使用限制性酶切位点BamHI和XhoI将所述鼠源cGAS酶基因构建至所述pet28a质粒中，所述大肠杆菌感受态细胞为BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌株。6.根据权利要求5所述的使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，其特征在于，所述分离纯化包括以下步骤：a)取培养上清液，抽滤，酸化，抽滤；b)使用大孔吸附树脂柱对步骤a)所得产物进行层析，获得第一2’3’-cGAMP粗品；c)使用离子交换树脂柱对所述第一2’3’-cGAMP粗品进行层析，获得第二2’3’-cGAMP粗品；d)使用C18柱对所述第二2’3’-cGAMP粗品进行层析，获得第三2’3’-cGAMP粗品；e)使用葡聚糖凝胶色谱柱对所述第三2’3’-cGAMP粗品进行层析，收集主峰，干燥后获得纯2’3’-cGAMP。7.根据权利要求3所述的使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，其特征在于，所述环二核苷酸为环二鸟苷酸c-di-GMP，所述目的基因为海栖热袍杆菌Thermotogamaritima的二鸟苷酸环化酶tDGCR158A基因tDGCm和人源干扰素刺激基因STINGCTD。8.根据权利要求7所述的使用重组大肠杆菌发酵制备环二核苷酸的方法，其特征在于，所述质粒为经改造pet15b和pet30a质粒，所述pet15...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱德裕，吕云，朱敬，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37