由β-葡聚糖中产生龙胆二糖或葡萄糖的新型β-1,6-内切葡聚糖酶制造技术

本发明专利技术涉及一种由β‑葡聚糖产生龙胆二糖或葡萄糖的新型β‑1,6‑内切葡聚糖酶，更具体地说本发明专利技术提供一种通过对β‑葡聚糖显示β‑1,6‑内切葡聚糖酶活性的β‑1,6‑内切葡聚糖酶以高产率产生龙胆二糖或葡萄糖的效果。

A New Type of Beta-1,6-endoglucanase Producing Gentiandiose or Glucose from Beta-Glucan

The present invention relates to a new type of beta 1,6 endoglucanase which produces gentianase or glucose from beta glucan. More specifically, the present invention provides an effect of producing gentianase or glucose in high yield by displaying beta 1,6 endoglucanase activity by beta glucan.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由β-葡聚糖中产生龙胆二糖或葡萄糖的新型β-1,6-内切葡聚糖酶
本专利技术涉及一种由β-葡聚糖产生龙胆二糖或葡萄糖的新型β-1,6-内切葡聚糖酶。
技术介绍
β-葡聚糖(β-glucan)是由通过糖苷键(glycosidicbond)连接的葡萄糖残基构成的多糖(polysaccharide)，且是构成酵母、蘑菇等的细胞壁的极重要组分。β-葡聚糖已长期广泛用于例如抗氧化剂效果、抗癌功能、皮肤保护剂等的应用。根据构成聚合物的键类型将β-葡聚糖划分成β-1,3-葡聚糖、β-1,4-葡聚糖以及β-1,6-葡聚糖，且已知β-1,6-葡聚糖相较于其它β-1,3-键或β-1,4-键以较小量存在于自然界中。衍生自疱脐衣属(Lasalliapustulata)的石耳素是β-1,6-葡聚糖的熟知代表性实例，且昆布糖也熟知为构成棕色海藻的β-1,3-1,6-葡聚糖。已知β-1,6-葡聚糖酶随机裂解β-葡聚糖的β-1,6-糖苷键(β-1,6-glycosidiclinkages)，且根据碳水化合物活性酶数据库(CarbohydrateActiveenZYmesdatabase；CAZy；http://www.cazy.org/)，已知β-1,6-葡聚糖酶属于糖苷水解酶(glycosidehydrolase，GH)家族5和糖苷水解酶家族30。衍生自真菌的β-1,6-葡聚糖酶主要报道为β-1,6-葡聚糖酶，且到目前为止无细菌β-1,6-葡聚糖酶的报道。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目标是提供一种能够由β-葡聚糖产生龙胆二糖或葡萄糖的新型β-1,6-内切葡聚糖酶的用途。技术解决方案为实现上述目标，本专利技术提供一种用于产生龙胆二糖或葡萄糖的组合物，所述组合物包含β-1,6-内切葡聚糖酶(β-1,6-endoglucanase)(包含SEQIDNO:1的氨基酸序列)，其中β-1,6-内切葡聚糖酶使用选自昆布糖(laminarin)和石耳素(pustulan)组成的组中的一或多个作为基质。本专利技术还提供一种产生龙胆二糖或葡萄糖的方法，所述方法包含使包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的β-1,6-内切葡聚糖酶(β-1,6-endoglucanase)与作为基质的选自昆布糖(laminarin)和石耳素(pustulan)组成的组中的一或多个进行反应。有利效果本专利技术提供一种关于β-葡聚糖展现β-1,6-内切葡聚糖酶活性的β-1,6-内切葡聚糖酶。β-1,6-内切葡聚糖酶可使用昆布糖或石耳素作为基质，由此提供高以产率产生龙胆二糖或葡萄糖的效果。附图说明图1是确认本专利技术的β-1,6-内切葡聚糖酶的表达的凝胶电泳照片。图2示出确认本专利技术的β-1,6-内切葡聚糖酶的最优活性pH值的结果。图3示出确认本专利技术的β-1,6-内切葡聚糖酶的最优活性温度的结果。图4示出确认本专利技术的β-1,6-内切葡聚糖酶的热稳定性的结果。图5是本专利技术的β-1,6-内切葡聚糖酶关于石耳素的水解的双倒数绘图(Lineweaver-Burkplot)。图6示出本专利技术的β-1,6-内切葡聚糖酶的水解产物关于石耳素的TLC(a)分析结果和HPLC(b)分析结果。图7示出本专利技术的β-1,6-内切葡聚糖酶的水解产物关于昆布糖的TLC(a)分析结果和HPLC(b)分析结果。图8是本专利技术的β-1,6-内切葡聚糖酶的系统发生树。具体实施方式本专利技术的专利技术人确认属于GH30家族的Gly30B蛋白质的β-葡聚糖降解活性，假定其具有β-糖苷酶活性。因此，Gly30B蛋白质使用昆布糖作为基质来裂解昆布糖的β-1,6-糖苷键，由此产生龙胆二糖或葡萄糖，且使用石耳素作为基质来裂解石耳素的β-1,6-糖苷键，由此产生龙胆二糖或葡萄糖，所述昆布糖是由β-1,3-连接的葡萄糖主链和β-1,6-连接的葡萄糖支链构成的多糖，所述石耳素是由β-1,6连接的葡萄糖构成的多糖。因此，本专利技术提供一种用于产生龙胆二糖或葡萄糖的组合物，所述组合物包含具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的β-1,6-内切葡聚糖酶，其中β-1,6-内切葡聚糖酶使用选自昆布糖和石耳素组成的组中的一或多个作为基质。本专利技术还提供一种龙胆二糖或葡萄糖的方法，所述方法包含使具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的β-1,6-内切葡聚糖酶与选自昆布糖和石耳素组成的组中的一或多个基质反应。β-1,6-内切葡聚糖酶关于β-葡聚糖展现β-1,6-内切葡聚糖酶活性。β-1,6-内切葡聚糖酶在范围介于约20℃到约45℃的温度下维持热稳定性，且关于昆布糖或石耳素展现最优降解活性。更具体地说，β-1,6-内切葡聚糖酶可在约20℃到约40℃的温度下展现最优活性。另外，缓冲剂中的β-1,6-内切葡聚糖酶的最优pH值可根据缓冲剂的类型而变化，且可范围介于约4到约10，更具体地说约6到约8，且更具体地说约7。β-1,6-内切葡聚糖酶可使用昆布糖、石耳素等作为基质。酶的反应产物可以是聚合度为2的龙胆二糖或葡萄糖。β-1,6-内切葡聚糖酶可衍生自变形菌株(Saccharophagusdegradans)2-40T，但本专利技术不受其特定限制。另外，β-1,6-内切葡聚糖酶可通过写码基因转录和转译，所述写码基因是与多肽的产生相关联的DNA片段，包含酶的写码区的上游区域和下游区域以及个别写码片段之间的插入序列。举例来说，β-1,6内切葡聚糖酶可由SEQIDNO:2的序列来转录和转译，但本专利技术不特别受限于此。另外，由一或多个取代、缺失、易位、添加等的前述酶不同且具有低聚糖或葡萄糖水解活性的突变蛋白也涵盖在本专利技术的酶的范围内，且其优选地具有与SEQIDNO:1的氨基酸序列至少80％同源性、至少85％同源性、至少90％同源性、至少93％同源性、至少94％同源性、至少95％同源性、至少96％同源性、至少97％同源性、至少98％同源性以及至少99％同源性的氨基酸序列。β-1,6-内切葡聚糖酶可从变形菌株2-40T培养液的上清液分离且纯化，且可使用基因重组技术产生且从除变形菌株2-40T以外的菌株分离或通过人工化学合成方法产生和分离。当使用重组技术时，可使用用于有助于重组蛋白表达的典型因素，例如耐抗生素基因和可用于亲和性管柱色谱法的报道体蛋白或肽，且此技术属于本专利技术的范围内，其可由本专利技术涉及的一般技术人员中的任一个容易地进行。举例来说，β-1,6-内切葡聚糖酶可从转染为包含核酸的重组载体的宿主细胞或其培养产物获得，所述核酸编码β-1,6-内切葡聚糖酶，即SEQIDNO:2的核苷酸序列。大肠杆菌也可用作宿主细胞，但本专利技术不限于此。可在范围介于20℃到45℃的温度和5到10的pH下使β-1,6-内切葡聚糖酶与基质的反应进行5分钟到1天。更具体地说，当将昆布糖或石耳素用作基质时，可在范围介于30℃到40℃的温度和6到8的pH下使反应进行5分钟到5小时。酶的降解产物可依序经历硅胶色谱(其是吸附色谱)和生物凝胶P2色谱(其是凝胶渗透色谱)，由此分离和纯化具有约95％高纯度的低聚糖或葡萄糖。如本文中所使用，术语“蛋白质”和“多肽”可互换地使用。在本专利技术中，多肽具有关于另一序列的某些百分比(例如，80％、85％、90％、95％或99％)的序列一致性意味着当两个序列关于彼此比对且进行比较时，两个序列在氨基酸残基中具有所提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种组合物，用于产生龙胆二糖或葡萄糖，所述组合物包括具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的β‑1,6‑内切葡聚糖酶，其中所述β‑1,6‑内切葡聚糖酶使用选自昆布糖以及石耳素组成的组中的一个或多个作为基质。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.07 KR 10-2016-00858681.一种组合物，用于产生龙胆二糖或葡萄糖，所述组合物包括具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的β-1,6-内切葡聚糖酶，其中所述β-1,6-内切葡聚糖酶使用选自昆布糖以及石耳素组成的组中的一个或多个作为基质。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述β-1,6-内切葡聚糖酶衍生自变形菌株2-40T。3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述β-1,6-内切葡聚糖酶从用重组载体转化的宿主细胞或所述宿主细胞的培养产物获得，所述重组载体包括编码所述β-1,6-内切葡聚糖酶的核酸。4.根据权利要求3所述的组合物，其中编码所述β-1,6-内切葡聚糖酶的所述核酸包括SEQIDNO:2的核苷酸序列。5.一种产生龙胆二糖或葡萄糖的方法，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：金京宪，王大毛，金度亨，
申请(专利权)人：高丽大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR