固定化酶催化法制备D-赤藓酮糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D‑赤藓酮糖的方法，该方法包括以下步骤：扩增EDH、EuK、LDH、PPK、AP基因，连接质粒并转入细胞，诱导蛋白表达后将细胞破碎离心分离纯化后得到5种酶，将酶固定化；取相应的酶解底物，加入固定化混合酶，反应生成D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸，纯化后得到D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸钠；将该底物与固定化磷酸水解酶AP反应，最终制得D‑赤藓酮糖。本发明专利技术方法利用丁醇糖氧化酶和羟基丙酮激酶的连续反应，实现了廉价的赤藻糖醇到D‑赤藓酮糖‑4‑磷酸的一次性完全转化，进而可以很方便地利用磷酸水解酶脱磷酸生成D‑赤藓酮糖。反应不会生成类似结构的产物，纯度和收率都得到了保证。

Preparation of D-erythritose by immobilized enzyme catalysis

The invention discloses a method for preparing D erythritose by continuous catalysis of immobilized enzymes. The method comprises the following steps: amplifying EDH, EuK, LDH, PPK and AP genes, connecting plasmids and transferring them into cells, after inducing protein expression, the cells are crushed, centrifuged, purified, and five enzymes are obtained, and the corresponding enzymatic hydrolysates are immobilized; adding Immobilized Mixed enzymes, and reversing. D erythritose 4 phosphoric acid should be produced and purified to obtain D erythritose 4 sodium phosphate. The substrate reacts with immobilized phosphatase AP to produce D erythritose. The method realizes the one-time complete conversion of cheap alginate alcohol to D erythritose 4 phosphoric acid by the continuous reaction of butanol sugar oxidase and hydroxyacetone kinase, and then can conveniently use phosphorylase to dephosphorylate to produce D erythritose. The reaction will not produce products with similar structure, and the purity and yield are guaranteed.

【技术实现步骤摘要】
固定化酶催化法制备D-赤藓酮糖的方法
本专利技术涉及D-赤藓酮糖的制备方法，具体涉及一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D-赤藓酮糖的方法。
技术介绍
D-赤藓酮糖(D-erythrulose)是一种四碳酮糖，分子式为C4H8O4，分子量为120，是存在于红浆果(常见于木莓)里一种呈黄色到红色的糖，由于该糖能与表皮死细胞膜表面蛋白氨基酸作用生成褐色色泽(brownishtint)，因而被广泛应用作安全、无毒的皮肤染料。D-赤藓酮糖常与二羟基丙酮(Dihydroxyacetone)混合应用于皮肤着色，产品通常以DHA/E调和染色标注(如：Tanfastic、Veneto等产品)。赤藓酮糖色调与二羟基丙酮略有区别，能使皮肤颜色更红、更热情。然而其昂贵的价格一直严重制约其进一步推广应用(参考价格表)，因而开发一种方便的、能大量制备赤藓酮糖的方法以降低其成本变得非常重要。各种相关化合物价格表：化合物名CASnumber公司价格($)D-苏糖(D-threose)95-43-2Carbosynth350/克L-苏糖(L-threose)95-44-3Carbosynth1000/克D-赤藓糖(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D‑赤藓酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)PCR扩增EDH、EuK、LDH、PPK、AP基因片段，然后连接到质粒上；再将质粒转入细胞中；(2)将转入了质粒的细胞置于37℃、含100μM氨苄青霉素的LB液体培养液中进行培养，当细胞增长至对数期后，加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷诱导蛋白表达4小时以上，收集细胞；(3)将步骤(2)收集的细胞破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵至终浓度为30‑50％(W/V)，直至有蛋白固体析出；离心收集蛋白，溶解到pH值8.0的Tris缓冲液中，再经G25尺寸排阻柱除盐、经DEAE Seplite FF阴离子交换...

【技术特征摘要】
1.一种利用固定化酶连续催化赤藻糖醇制备D-赤藓酮糖的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)PCR扩增EDH、EuK、LDH、PPK、AP基因片段，然后连接到质粒上；再将质粒转入细胞中；(2)将转入了质粒的细胞置于37℃、含100μM氨苄青霉素的LB液体培养液中进行培养，当细胞增长至对数期后，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导蛋白表达4小时以上，收集细胞；(3)将步骤(2)收集的细胞破碎、离心，在上清液中逐量加入硫酸铵至终浓度为30-50％(W/V)，直至有蛋白固体析出；离心收集蛋白，溶解到pH值8.0的Tris缓冲液中，再经G25尺寸排阻柱除盐、经DEAESepliteFF阴离子交换柱分离，得到纯化的EDH、EuK、LDH、PPK、AP液体酶；(4)将EDH、EuK、LDH与PPK的纯化混合酶溶解在缓冲液中，随后加入环氧树脂，室温搅拌24小时以上，酶固定在环氧树脂上，过滤出环氧树脂，用清水和缓冲液洗涤，最后在4℃干燥；AP依同样的步骤单独固定；(5)在缓冲液中加入赤藻糖醇、丙酮酸钠、多聚磷酸、三磷酸腺苷二钠盐ATP、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸单钠盐、氯化镁和氯化钾，调节pH值到8.0，加入EDH、EuK、LDH与PPK的固定化混合酶，在25-40℃轻微搅拌反应4小时以上，生成D-赤藓酮糖-4-磷酸；过滤反应液回收环氧树脂及其固定化酶，在滤液中加入草酸钡和两倍滤液体积的乙醇，用于沉淀D-赤藓酮糖-4-磷酸及磷酸腺苷；离心收集沉淀，溶解在pH值小于7的Tris缓冲液中，加入无水硫酸钠析出不溶性硫酸钡；过滤除去不溶性钡盐，并将滤液pH值上调到7.0，上样阴离子交换树脂柱，并以梯度碳酸氢氨水溶液洗脱，碳酸氢氨浓度从0逐渐升至1.0M，未含磷酸基团的有机杂质最先从交换柱中洗脱出来，之后，含单磷酸基团的D-赤藓酮糖-4-磷酸逐渐被洗脱出来，而含多个磷酸基团...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄华，高睿迪，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：广东,44