一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以及生产海藻糖的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以及生产海藻糖的方法，涉及生物工程和酶工程领域。该方法是以能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌作为出发菌株，以二氧化碳释放率通过二氧化碳释放率反馈调节的方式控制发酵过程中各种参数，已达到操作简单、菌体密度高、酶活效价高的目的，同时通过该方法得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶在使用双酶法生产海藻糖时，可提高海藻糖的收率，可达80％以上。

Method for producing malt oligosaccharide based trehalose synthetase, malt oligosaccharide based trehalose hydrolase and method for producing trehalose

The invention discloses a method for producing malt oligosaccharide based trehalose synthetase, malt oligosaccharide based trehalose hydrolase and a method for producing trehalose, relating to the field of biological engineering and enzyme engineering. The method is based on the recombinant expression of maltooligosyltrehalose synthase or MTHase strain as the starting strain, the release rate of carbon dioxide through the carbon dioxide release rate feedback parameters in fermentation process control methods, has reached the simple operation, high cell density, enzyme titer to malt oligosaccharyl trehalose synthase or maltooligosyl trehalose also obtained by the method of enzymatic hydrolysis in the production of trehalose using double enzyme method, can improve the yield of trehalose can reach more than 80%.

【技术实现步骤摘要】
一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以及生产海藻糖的方法
本专利技术涉及生物工程和酶工程领域，具体而言，涉及一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以及生产海藻糖的方法。
技术介绍
海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α，α-1，1糖苷键结合的非还原性糖，它广泛存在于细菌、酵母、藻类、真菌、昆虫以及一些抗逆性植物中。海藻糖对细胞膜、蛋白质、核酸等生物大分子具有非特异性的保护作用，具有良好的吸水性、稳定、且不易焦糖化。外源性的海藻糖同样对生物体和生物大分子有非特异性的保护作用，海藻糖这种独特的生物学性质使其在食品、医药、化妆品、疫苗等领域有重要的应用。海藻糖的生产方法主要有微生物提取法、发酵法和酶转化法。微生物提取法是指乳酸菌、酵母、霉菌等为提取源，通过干燥、高渗等逆境处理使其积累海藻糖，然后经有机溶剂抽提、精制得到海藻糖。此方法海藻糖含量低，提取效率低，成本过高，不适合工业化生产。发酵法一般是先经过诱变、细胞融合、基因重组等方法选育海藻糖的高产菌株，然后采用高浓度培养基及高渗条件发酵，并在发酵结束前进行饥饿处理，从而得到海藻糖较高的培养物。这些菌株包括节杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微球菌属等。但是高产菌株选育困难，转化率低，副产物多，提取精制困难，因此也很难实现工业化生产。酶法生产海藻糖根据底物来区分主要有三种：一是以葡萄糖为底物，二是以麦芽糖为底物，三是以淀粉为底物。以葡萄糖为底物的反应如下：UDP葡萄糖与葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷合成酶的作用下生成海藻糖-6-磷酸，海藻糖-6-磷酸在海藻糖-6-磷酸酯酶的作用下生成海藻糖，由于此方法中的需要以葡萄糖-6-磷酸为糖基受体，UDP-葡萄糖、ADP-葡萄糖、GDP-葡萄糖为糖基供体，需要反应体系提供很高的能量，因此难以工业化生产。以麦芽糖为底物是在海藻糖合成酶的作用下将α-1，4-麦芽糖在分子内重组成α-1，1-海藻糖。以麦芽糖为底物：海藻糖合成酶具有较严格的底物专一性，只作用于麦芽糖生成海藻糖及海藻糖生成麦芽糖。此方法反应工艺简单，易于控制，底物麦芽糖价格便宜，耐热菌中的海藻糖合成酶热稳定性好，因而使用耐热菌可避免工业生产中杂菌的污染，这是较理想的工业生产途径。但海藻糖合成酶催化的是一个可逆反应，它既可以催化麦芽糖生成海藻糖，也可以催化海藻糖生成麦芽糖，当反应进行到一定程度时麦芽糖与海藻糖的转化会达到相对平衡，因此转化率达到70％以后难以再有提高。以淀粉为底物的反应是在麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)与麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的作用下进行的。麦芽寡糖基海藻糖合成酶是一种分子内转糖基酶，催化麦芽寡糖(淀粉液化液)还原端的葡萄糖基和相邻的葡萄糖基间的α-1，4-葡萄糖苷键转化成α-1，1-葡萄糖苷键，生成麦芽寡糖基海藻糖；麦芽寡糖基海藻糖水解酶专一水解麦芽寡糖基海藻糖的麦芽寡糖基和海藻糖基间的α-1，4-糖苷键，以上两种酶联合作用，每次从麦芽寡糖生成海藻糖和少两个葡萄糖单位的麦芽寡糖，此方法已经用于海藻糖的工业化生产。双酶法生产海藻糖主要成本是生产双酶的成本。现国内主要使用转基因大肠杆菌为出发菌种，通过高密度培养菌体积累生产所需酶，生长完成破碎菌体提取酶。所以高密度培养的菌体密度是生产成本的关键，单批菌体密度越高相对总生产成本越低。高密度培养的关键是生产过程中的各种参数控制，转基因大肠杆菌发酵生长过程中需要控制溶氧(DO)、pH、葡萄糖含量、转速、风量、温度等等条件，而且生长控制过程中调节一个参数相应会有几个参数发生改变需要调整，比如需要DO提高，可以提高转速，但提高转速以后菌体生长速率改变葡萄糖含量会发生改变需要提高补糖速率，补糖速率增加，随着菌体生长消耗葡萄糖多DO又会下降，所以需要几个因素不停调整，工人操作难度较大，菌生长不稳定影响最终得菌体密度和酶效价。所以需要一套成熟的控制工艺，使达到高密度发酵同时菌体生长稳定产酶效价较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，该方法以二氧化碳释放率作为发酵参数对其进行控制，进而实现对发酵过程中各种参数的有效控制，克服现有发酵技术过程反复不停地调节各种参数的缺陷，以实现操作简单、菌体密度高、酶活效价高的目的。本专利技术的另一目的在于提供一种生产海藻糖的方法，该方法以上述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法得到的寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶接触底物生产出海藻糖，该两种酶具有高酶活效价的特点，因此该方法具有操作简单、海藻糖收率高的特点。本专利技术是这样实现的：一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其包括：以二氧化碳释放率作为发酵参数，通过控制二氧化碳释放率对能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌进行发酵培养，得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶。一种生产海藻糖的方法，其包括：用上述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶接触底物。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以二氧化碳释放率作为发酵参数，通过控制二氧化碳释放率对能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌进行发酵培养，该方法通过控制二氧化碳释放率，实现对发酵过程中的其他参数例如溶氧、转速以及补糖速率等参数的控制，克服现有发酵技术中需要不断地反复地调整多个参数例如溶氧、转速以及补糖速率等参数的缺陷，实现操作简单、菌体密度高、酶活效价高的目的，以该方法所得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶进行双酶法生产海藻糖，具有提高海藻糖收率的特点，收率可达80％以上。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实施例1提供的CER随发酵时间增加而上升的变化曲线图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的及一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法以及生产海藻糖的方法进行具体说明。一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其包括如下步骤：(1)一级种子摇瓶(含液体LB培养基)接种能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌，接种量1％，37℃培养，培养8小时左右以后(OD600值大于2)，得到一级种子活化液。(2)将一级种子活化液接入二级种子罐(含液体LB培养基)，接种量4％，控制反应温度37℃，溶氧(DO)大于10％，pH7.0(20％氨水调节)，培养10小时左右(OD600值大本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，其包括：以二氧化碳释放率作为发酵参数，通过控制所述二氧化碳释放率对能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌进行发酵培养，得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶。

【技术特征摘要】
1.一种生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，其包括：以二氧化碳释放率作为发酵参数，通过控制所述二氧化碳释放率对能够表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的重组工程菌进行发酵培养，得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶。2.根据权利要求1所述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，控制所述二氧化碳释放率是指：调节所述二氧化碳释放率从初始值上升至289-303mmolCO2/L·h。3.根据权利要求2所述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，控制所述二氧化碳释放率是指：在发酵起始时至发酵第9.5-10.5小时的阶段，调节所述二氧化碳释放率从所述初始值上升至38-42mmolCO2/L·h，然后用诱导剂进行诱导，调节所述二氧化碳释放率继续上升至289-303mmolCO2/L·h。4.根据权利要求3所述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，所述诱导剂为D-阿拉伯糖。5.根据权利要求1-4中任一项所述的生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶或麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵伟，曹大鹏，段莹莹，任峰，范秀旺，高文学，
申请(专利权)人：山东福洋生物制造工程研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37