提升耐温性的纤维素酶制造技术

本发明专利技术涉及一种提升耐温性的纤维素酶，其氨基酸序列系为将序列编号2的N端加上半胱氨酸(Cysteine)，以及在C端加上甘氨酸(Glycine)及半胱氨酸(Cysteine)或是加上脯氨酸(Proline)及半胱氨酸(Cysteine)的序列。

Cellulase for improving temperature resistance

The invention relates to a method for improving heat resistance of cellulase and its amino acid sequence is the sequence number 2 N end with cysteine (Cysteine), and in the end C plus glycine (Glycine) and cysteine (Cysteine) or plus proline (Proline) and cysteine (Cysteine) sequence.

【技术实现步骤摘要】
提升耐温性的纤维素酶
本专利技术涉及一种纤维素酶，尤指一种提升耐温性的纤维素酶。
技术介绍
纤维素是植物细胞壁的主要组成之一，也是地球上主要生物质能(biomass)的来源，因此，现今许多能够有效分解纤维素的酶蛋白在不同工业上的应用也十分广泛。纤维素是由葡萄糖为单位，以β-1,4-糖苷键(β-1,4-glycosidicbond)所键结而成的长链多糖，这些多糖体共同组织排列成紧密的结晶型纤维素，进而抵抗外界的分解作用。然而，生物界中许多草食动物以及微生物等需要藉由将植物细胞壁中的多糖纤维素分解成可以被体内吸收的葡萄单糖，以作为生存能量来源。纤维素酶的催化机制主要是藉由酸碱反应，将连接两个单糖的β-1,4-糖苷键进行水解作用，进而分解多糖纤维素。而纤维素酶基本上可分成三类，分别为内切葡聚糖酶(endo-glucanase)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase)以及葡萄糖苷酶(β-glucosidase)。内切葡聚糖酶能够随机地将长链纤维素切成许多小片段的寡糖；而外切葡聚糖酶则可从长链纤维素的还原端或非还原端进行分解，其主要产物为纤维二糖；至于葡萄糖苷酶则可把纤维二糖分解为单糖的葡萄糖。纤维素酶在工业上的应用十分广泛，不论是在食品、饲料或纺织业，甚至可运用到现在最受关注的生物质能源。针对不同工业的应用，纤维素酶也需有符合其不同的适用条件与范围。举例而言：饲料工业上适合偏酸性以及耐温的酶蛋白，然而纺织工业上则是偏好偏碱性的纤维素酶。因此，能够找出更加符合不同工业上所需的酶蛋白也是目前不论是学术或产业界都在努力的目标。目前在许多相关的研究中，为了得到更佳的酶，除了在自然界中筛选出来之外，就是将现有的酶蛋白加以改造。现今主要有两大改造策略，其一是随机突变或是将酶基因随机排列，再于特定的作用条件之下，筛选出更符合其作用条件的酶蛋白。此策略的好处是无须深入研究酶的结构或作用机制，而是直接在特定的条件下随机去找出更好的酶蛋白；然而，其缺点即是需要大量的人力以及时间去进行大量筛选或是要有很好的大量筛选方法来配合。另一种改造策略则是藉由研究酶结构与作用机制以找出对于酶活性或特性具有关键性的氨基酸，并针对这些特定氨基酸进行突变并测试，进而得到功能性更强的改造酶蛋白。此优点是不需花费时间与人力在大量突变与筛选的步骤，但需要先了解此酶的蛋白结构以及其作用机制，才能找出具改造潜力的特定氨基酸。不同的工业制程需要符合其不同作用环境的酶蛋白来配合且参与。即便纤维素酶在工业上被广泛应用已久，然而许多工业用酶是从嗜常温菌，如里式木霉(Trichodermareesei)所筛选出来的，因此耐热性也较差。另一方面，耐热性纤维素酶能够有效地应用于需要高温作用环境的产业上，包含啤酒制成或是生质能源工业等。具耐热性的蛋白相对地其蛋白稳定度也会较高，因此能够在高温环境中稳定存在，甚至作用地更好。不论是在作用环境或是后段处理过程中，也不需担心会因为高温而破坏了酶蛋白本身。此外，酶蛋白的活性也是改良工业酶的一大重点，酶活性愈高就代表成本的下降以及利润的提高。根据文献研究，双硫键有助于蛋白结构的稳定以及提升耐热性。里式木霉具有许多种纤维素酶，其中属GHfamily5的Cel5A纤维素酶，其蛋白结构(ID3QR3)在2011年发表，结构内部具有四个双硫键位置在C16-C22、C92-C99、C232-C2683以及C273-C323，因此具有较高的溶解温度(Tm值)，另外，Cel5A的结构呈现α/βTIMbarrel的结构类型(ToniMLee,MaryFFarrow,FrancesHArnold,andStephenLMayo.(2011)ProteinStructureReport,nov27；20(11):1935-40.)。而在2004年SimonR.Andrews等人研究发现，Cellvibriojaponicas木聚糖酶蛋白CjXyn10A与Cellvibriomixtus的CmXyn10B，在其N端与C端增加双硫键键接，能够进一步稳定结构进而提升温度的耐受性，而CjXyn10A与CmXyn10B其结构也是属于α/βTIMbarrel型态(AndrewsS.R.,TaylorE.J.,PellG.,VincentF.,DucrosV.M.,DaviesG.J.,LakeyJ.H.,andGilbertH.J.,(2004)J.Biol.Chem.Dec24；279(52):54369-79.)。因此，本专利技术欲藉由改造基因以增加纤维素酶的双硫键键接，藉此提升纤维素酶对于温度的耐受性，以有效增加纤维素酶在工业上应用的产业价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于改造现有纤维素酶，利用结构分析及点突变技术，增加纤维素酶的双硫键键接，以有效提升纤维素酶的耐温性，进而增加纤维素酶的工业应用价值。为达上述目的，本专利技术的一个较广义实施方式提供一种纤维素酶，其氨基酸序列是将序列编号2的N端加上半胱氨酸(Cysteine)，以及在C端加上甘氨酸(Glycine)及半胱氨酸(Cysteine)或是加上脯氨酸(Proline)及半胱氨酸(Cysteine)的序列。其中编码该序列编号2的基因是从里式木霉(Trichodermareesei)所分离出来并经优化的基因。在一实施例中，该纤维素酶的氨基酸序列是序列编号4的氨基酸序列。在一实施例中，该纤维素酶的氨基酸序列是序列编号6的氨基酸序列。又，本专利技术的另一个较广义实施方式提供一种编码该纤维素酶的核酸分子及包含该核酸分子的重组质粒。附图说明图1显示WT纤维素酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图2显示引物一的突变引物序列。图3显示引物二的突变引物序列。图4显示引物三的突变引物序列。图5显示改造后的CGC纤维素酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图6显示改造后的CPC纤维素酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图7显示WT纤维素酶与CGC纤维素酶及CPC纤维素酶两种突变蛋白的耐温性分析。图8显示评估双硫键接的SDS-PAGE电泳分析。具体实施方式体现本专利技术特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本专利技术能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本专利技术的范围，且其中的说明及图示在本质上应当作说明之用，而非用以限制本专利技术。本专利技术采用的纤维素酶是从里式木霉(Trichodermareesei)菌株中所分离出来的基因，并经优化且去除N端91个氨基酸的序列，以提升其蛋白表达能力。此基因未经突变处理，故以野生型纤维素酶称之(以下简称WT纤维素酶)。前述WT纤维素酶的两端是以EcoRI与NotI限制酶位置衔接在pPICZαA载体上，并进行定序及蛋白表达。图1即显示WT纤维素酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中，WT纤维素酶基因包含984个碱基(含终止密码子，核苷酸序列以序列编号1标示)以及327个氨基酸(氨基酸序列以序列编号2标示)。进一步利用PyMOL软件分析结构，发现WT纤维素酶的N端与C端之间空间距离约大于形成双硫键的距离。因此，本专利技术尝试将N端与C端两端各加上一个Cysteine(半胱氨酸)之外，更在C端Cysteine前增加一个分子较小的Glycine(甘氨酸)或是让长链产生角度偏转的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纤维素酶，其氨基酸序列是将序列编号2的N端加上半胱氨酸(Cysteine)，以及在C端加上甘氨酸(Glycine)及半胱氨酸(Cysteine)或是加上脯氨酸(Proline)及半胱氨酸(Cysteine)的序列。

【技术特征摘要】
1.一种纤维素酶，其氨基酸序列是将序列编号2的N端加上半胱氨酸(Cysteine)，以及在C端加上甘氨酸(Glycine)及半胱氨酸(Cysteine)或是加上脯氨酸(Proline)及半胱氨酸(Cysteine)的序列。2.如权利要求1所述的纤维素酶，其中编码该序列编号2的基因是从里式木霉(Trichoder...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭瑞庭，郑雅珊，黄建文，吴姿慧，赖惠琳，林正言，柯宗佑，
申请(专利权)人：东莞泛亚太生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44